Птичий Семен коллекции клоаки массаж и изоляции ДНК из спермы
Summary
Этот протокол описывает клоаки Массаж, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц и экстракции ДНК от птичьего спермы с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями.
Abstract
Коллекция спермы может быть полезным для широкого спектра приложений, включая исследования с участием качества спермы, сперма теломер динамики и эпигенетики. Птицы являются широко используемых предметов в биологических исследованиях и идеально подходит для исследования образцов неоднократные спермы. Однако мало ресурсов в настоящее время доступны для тех, кто хочет научиться собирать и извлечь ДНК от птичьего спермы. Здесь мы описываем клоаки Массаж, нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора птичьего спермы. Хотя этот метод установлен в литературе, это может быть трудно узнать из имеющихся описаний. Мы также предоставляем информацию для извлечения ДНК от птичьего Семен, с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями. Клоаки массаж легко может использоваться на любых малого среднего размера мужчина птица в репродуктивного состояния. После сбора спермы можно использовать немедленно для анализов подвижность, или замороженные для экстракции ДНК после протокол, описанные здесь. Этот протокол извлечения был усовершенствован для птичьего спермы и успешно используется на образцы, собранные из нескольких видов воробьиных (Passer domesticus, Воробьиные овсянки Овсянковые кардиналы, гракл Haemorhousи migratorius дрозд ) и один columbid (Columba livia).
Introduction
Птицы являются идеальным темы для исследований с участием качества спермы и конкуренции1, спермы теломер динамики2, эпигенетики3и подобные темы, как они широко используются в биологических исследованиях и спермы можно легко попробовать с помощью клоаки Массаж. Клоаки массаж – нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц4,5,6. Повторные образцы могут быть легко получены, и требуются никаких специальных инструментов, что делает его простым для выполнения в поле или лаборатории. Хотя клоаки массаж был в использовании на протяжении десятилетий, трудно узнать из доступных письменного описания. Эта публикация предназначена для сокращения времени и неопределенности, участвующих в процессе обучения клоаки массаж.
Семен, собранных от птиц, используя клоаки массаж может быть немедленно использованы для оценки подвижности4,7 или искусственного оплодотворения8или замороженные для других целей, например расширенные изображений и экстракции ДНК. Образцы спермы от воробьиных птиц малы, но содержат плотно упакованных спермы. ДНК добывается с использованием коммерческой добычи комплект для простоты, с изменениями для преодоления специализированные защитные функции сперматозоиды9. После извлечения спермы теломеры может быть измерена с помощью ПЦР10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы опишем простой и надежный способ для сбора спермы от малых и средних птиц в состоянии репродуктивно активных и извлечения ДНК от птичьего спермы.
Протокол извлечения ДНК описанных Семен изменен из комплекта для простоты, но был доработан для использования на птичий с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Хосе Noguera для ранней помощи с клоаки Массаж, и Джеффри Kittilson для лаборатории поддержки. Эта работа была поддержана премию ND EPSCoR FAR0022429 для BJH. Расходы на публикации были щедро поддерживает Департамент биологических наук NDSU.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
