Avian Semen samling av Cloacal massasje og isolering av DNA fra Sperm
Summary
Denne protokollen beskriver cloacal massasje, en ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling av sæd fra fugler og DNA utvinning fra avian sperm bruke en kommersiell utvinning kit med endringer.
Abstract
Samling av sæd kan være nyttig for en rekke applikasjoner inkludert studier med kvaliteten, sperm telomere dynamics og epigenetics. Fugler er brukte fag i biologiske, og er ideelle for studier som involverer gjentatte sperm prøver. Men er få ressurser tilgjengelige for de som ønsker å lære å samle og ekstra DNA fra avian sperm. Her beskriver vi cloacal massasje, en mild, ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling av avian sperm. Men denne teknikken er etablert i litteraturen, kan det være vanskelig å lære fra de tilgjengelige beskrivelsene. Vi gir også informasjon for uttrekking av DNA fra avian sæd ved hjelp av en kommersiell utvinning kit med modifikasjoner. Cloacal massasje kan enkelt brukes på alle små – og mellomstore mannlig fuglene i reproduktive tilstand. Følgende samling, sæd kan brukes umiddelbart for motilitet analyser eller frosset i DNA utvinning følger protokollen beskrevet her. Dette utvinning var raffinert for avian sædcellene og har blitt brukt på prøver fra flere ei gruppe arter (forbipasserende domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusog Turdus migratorius ) og en columbid (Columba livia).
Introduction
Fugler er ideelle fag for studier som involverer kvaliteten og konkurranse1, sperm telomere dynamics2, epigenetics3og lignende emner, som mye brukt i biologisk forskning og sperm kan lett samplet bruker cloacal massasje. Cloacal massasje er en mild, ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling sæd fugler4,5,6. Gjentatt prøvene kan hentes lett spesial verktøy er nødvendig, noe som gjør det enkelt å utføre i feltet eller laboratorium. Selv cloacal massasje har vært i bruk i flere tiår, er det vanskelig å lære fra tilgjengelig skrevet beskrivelser. Denne publikasjonen er ment å redusere tid og usikkerhet involvert i å lære cloacal massasje.
Sæd fra fugler bruke cloacal massasje kan brukes umiddelbart for motilitet vurdering4,7 eller kunstig insemination8eller frosset for andre bruksområder som avansert bildebehandling og DNA utvinning. Sæd prøver fra ei gruppe fugler er små, men inneholder tettpakkede sperm. DNA trekkes ut ved hjelp av en kommersiell utvinning kit for enkelhet, med modifikasjoner å overvinne de beskyttende spesialfunksjoner sperm9. Etter ekstraksjon, kan sperm telomeres måles med qPCR10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en enkel og pålitelig metode for innsamling av sæd fra små og mellomstore fugler i reproductively aktiv tilstand og utdrager DNA fra avian sperm.
Beskrevet sæd DNA utvinning protokollen endres fra et kit for enkelhet, men ble raffinert for bruk på avian sæd. Sperm er motstandsdyktig mot lysis av standard utvinning kjemikalier9,13, og sæd prøver fra spurvefugler er ganske liten (vanligvis noen microliters). Disse fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jose Noguera for tidlig hjelp med cloacal massasje og Jeffrey Kittilson for laboratorium støtte. Dette arbeidet ble støttet av en ND EPSCoR FAR0022429 prisen til likevel. Publikasjonen kostnader ble sjenerøst støttet av NDSU departementet av biologisk vitenskap.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
