这里,我们描述了一种用于细胞在胰腺微环境从胚胎,新生儿和成年小鼠组织的隔离,着眼于间充质细胞的分离。此方法允许细胞基因表达和蛋白质分泌的分析以阐明调节胰腺发育,功能,和肿瘤发生的外在信号。
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
能量平衡和哺乳动物食物的消化依赖于适当的胰腺功能。成人胰腺由两个主要细胞区室的:外分泌和内分泌。外分泌细胞,包括产生和分泌消化酶和运输这些酶肠道管细胞,包括总胰1质量的80%以上的腺泡细胞。内分泌细胞,包括生产胰岛素的β细胞和胰高血糖素生产的α细胞中,在该嵌入外分泌组织和分泌的激素来调节血糖水平2胰岛被组织。
胰腺细胞通过一个高度调节,多步骤的过程3获得其分化命运。有证据表明,由神经元细胞,内皮细胞,和间质细胞提供外在线索引导在叔胰腺细胞的分化和增殖他胚胎3,4,5。一个例子是主动脉早期胰前体6的规范的要求。后来在发展,被示出的内皮细胞中都胰腺内分泌和外分泌细胞的发展中发挥中心作用,并促进β细胞分化4,6,7。被示出的间质细胞,以支持存活和共同胰祖细胞的扩增,主要是通过生长因子FGF10 8,9的分泌。我们已进一步显示,这些细胞支持内分泌和外分泌的前体在胚胎胰腺5的扩散,以及分化的细胞(包括腺泡和β细胞)。最近,间充质细胞还证明是调节内分泌细胞的分化10。
在成人中,β细胞功能和质量均表现依赖于细胞中的微环境,包括神经元细胞,免疫细胞和内皮细胞,以及周细胞11,12,13。在损伤,均表现内皮细胞招募免疫细胞到胰腺,促进β细胞复制13。内皮细胞进一步示出,以产生细胞外基质(ECM)组件以支持胰岛素表达和β细胞功能14。我们最近表现出胰岛周细胞对β细胞功能11的要求。最后,被示出的胰基质的细胞来调节胰腺导管腺癌(PDAC)15,16的进展。然而,标识指导胰腺发育,功能和肿瘤外在线索的实体,在很大程度上是未知。
识别由胰腺微环境的细胞提供线索需要表征由这些细胞表达的基因和蛋白质。这依赖于以和/或建立的细胞系进行基因表达和蛋白质组分析中分离从胰腺这些细胞。这里,我们提出了一种方法,通过利用表达荧光蛋白或免疫荧光标记的细胞或细胞组织的酶消化和荧光激活细胞分选(FACS)对胰腺微环境的间充质细胞分离。成功地执行该协议,以分离和分析黄色荧光蛋白(YFP)-expressing胚胎,新生儿和成人胰腺5,17间充质细胞。
在这里,我们描述了分离和分析胰腺微环境细胞的方法。这种方法可用于间充质细胞从胚胎和成年胰腺组织隔离。此外,我们成功地使用该协议来隔离从成人和新生儿胰腺5,17内皮细胞。然而,这可能不适合用于获得胰腺上皮细胞的可重复的单细胞悬浮液(可替代的协议在参考文献18中,23中描述,和24)。使用这种方法,荧光标记的细胞中,无论是表达荧光蛋白或免疫染色表面标记,可以通过FACS进行纯化或通过流式细胞仪分析。 RNA可以从纯化细胞提取介绍他们的基因表达模式。可选择地,纯化的细胞可以培养以建立用于随后的蛋白组学分析的细胞系。这种方法将使因素e的表征胰腺微环境,从而规范其器官,生理和病理生理学xpressed。
胰腺间叶细胞通过促进前体和分化的细胞5,9增殖支持组织器官。这些细胞被示出为支持人类胚胎干细胞的膨胀(人类胚胎干细胞)衍生的胰腺祖细胞17,25,26。因此,描绘的胚胎间充质因素的身份将促进目前的努力,以产生由hESCs和诱导多能干细胞(iPS细胞),为潜在的治疗糖尿病产生胰岛素的β细胞。小鼠遗传学研究允许的生长因子,如FGF10,由间质中产生的识别期间胰腺发育的早期阶段,以促进胰腺上皮膨胀3,9。与识别所述胚胎间充质表达的附加因素的目的,我们分离使用激光捕获显微切割这些细胞中,提取它们的RNA,并进行基因表达分析26。然而,除了是劳动密集的,这种方法依赖于识别基于其形态特征,其中上皮的分支进入周围间质( 即,E12.5)之前限制了它的使用,以发育阶段的细胞。在后来的发展阶段的特征的间质细胞,我们采用这里5,17中记载的方法。
我们使用这种方法新生儿胰腺间质5,分析表面标志物的表达。此外,间充质细胞从Nkx3.2 -Cre的胚胎和新生儿胰组织中分离; R26-EYFP小鼠,是根据它们的荧光标记在这个鼠标线,并进行培养,建立细胞系17。这些细胞允许由胰腺间质与促进人类胚胎干细胞衍生的胰腺祖17的能力分泌因子识别的蛋白质组学分析。我们进一步用这种细胞的分离方法,以从RNA提取和基因表达分析17成人胰腺组织纯化的间充质细胞。因此,这种方法可以用于识别由胰腺间充质表达的基因和蛋白质,具有支持胰腺细胞发育的能力。
胰腺间充质细胞进一步显示出在胰腺肿瘤发生的作用。 PDAC的特征在于形成由成纤维细胞,免疫细胞的丰富成纤维结缔组织增生基质,和ECM 27。虽然基质被认为推动了许多发展类型的癌症中,显示抑制PDAC进展15,16,28。这表明,胰基质组分分泌抑制肿瘤发生的因素。此外,在间质细胞的组合物,以及在细胞表型的变化可以背后上的上皮细胞15,16,28的作用。因此这里描述的方法可以协助在表征不同类型的细胞,使一个PDAC基质相比,健康胰腺组织。这将进一步允许不同基质的细胞类型的纯化PDAC进展过程中表征其基因表达谱电位变化。然而,由于肿瘤27期间在胰腺癌的ECM组合物的变化,组织消化参数的调整,如纳入ADDIT的有理胶原酶类型或增加孵育时间,可能是需要的。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |