Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van cellen in de pancreas micro uit embryonale, neonatale en volwassen muis weefsel, gericht op het isoleren van mesenchymale cellen. Deze methode maakt profilering cel genexpressie en secretie eiwitten om de extrinsieke signalen die pancreas ontwikkeling, functie en tumorigenese reguleren helderen.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Energie homeostase en de vertering van voedsel bij zoogdieren afhankelijk zijn van de juiste functie van de alvleesklier. De volwassen pancreas omvat twee belangrijke cellulaire compartimenten: de exocriene en endocriene. Exocriene cellen, waaronder acinaire cellen die produceren en uitscheiden spijsverteringsenzymen en ductale cellen die deze enzymen transporteren naar de darm, omvatten meer dan 80% van de totale massa alvleesklier 1. Endocrine cellen, die insuline producerende beta-cellen en glucagon producerende a-cellen omvatten, zijn georganiseerd in de eilandjes van Langerhans die zijn ingebed in de exocriene weefsel en hormonen afscheiden bloedglucose niveaus 2 reguleren.
Alvleesklier cellen verwerven hun gedifferentieerde lot door middel van een sterk gereguleerde, multi-step proces 3. Er zijn aanwijzingen dat extrinsieke signalen door neurale, endotheliale en mesenchymale cellen begeleiden pancreas cel differentiatie en proliferatie in tHij embryo 3, 4, 5. Een voorbeeld is de eis van de aorta voor de specificatie van vroege pancreatische voorlopers 6. Later in ontwikkeling, werden endotheelcellen aangetoond dat een centrale rol spelen bij de ontwikkeling van zowel pancreatische endocriene en exocriene cellen en beta-celdifferentiatie 4, 6, 7 bevorderen. Mesenchymale cellen bleken de overleving en groei van gemeenschappelijke pancreatische voorlopercellen te ondersteunen, met name door de afscheiding van de groeifactor Fgf10 8, 9. We hebben verder aangetoond dat deze cellen ondersteunen de proliferatie van endocriene en exocriene precursoren, en gedifferentieerde cellen (waaronder acinaire en beta-cellen) in de embryonale pancreas 5. Onlangs, mesenchymale cellen werden verdergetoond regulering endocrine cellen differentiatie 10.
Bij volwassenen beta-celfunctie en massa werden naar afhankelijk cellen in hun micromilieu, zoals neuronale, immuun en endotheelcellen, pericyten en 11, 12, 13. Tijdens letsel, werden endotheelcellen aangetoond dat immuuncellen werven om de alvleesklier om beta-cel-replicatie 13 te promoten. Endotheelcellen werden verder aangetoond extracellulaire matrix (ECM) componenten tegen insuline expressie en beta-celfunctie 14 ondersteunen. We hebben onlangs aangetoond dat de eis van eilandje pericytes voor beta-celfunctie 11. Tenslotte cellen van de pancreas stroma bleken de progressie van pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) 15, 16 te regelen. De identiteit van extrinsieke signalen dat de ontwikkeling van de pancreas, de functie en het ontstaan van tumoren te begeleiden zijn grotendeels onbekend.
Identificeren signalen door cellen van de alvleesklier micro vereist karakteriseren van de genen en eiwitten die door deze cellen tot expressie. Dit is afhankelijk van het isoleren van deze cellen uit de alvleesklier om genexpressie en proteoomanalyse voeren en / of de instelling cellijnen. Hier stellen we een methode om mesenchymale cellen van de alvleesklier micro isoleren door gebruik weefsel enzymatische digestie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van ofwel immunofluorescently gelabelde cellen of cellen die fluorescerende eiwitten. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en analyseren geel fluorescerend eiwit (YFP) -expressie mesenchymale cellen van de embryonale, neonatale en volwassen pancreas 5, 17.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en cellen van de pancreas micro analyseren. Deze methode kan worden gebruikt om mesenchymale cellen te isoleren van embryonale en volwassen pancreas weefsel. Daarnaast hebben we met succes gebruikt dit protocol om endotheelcellen van volwassen en neonatale pancreas 5, 17 isoleren. Het kan echter niet geschikt voor het verkrijgen van een reproduceerbare eencellige suspensie van pancreatische epitheelcellen (alternatieve protocollen worden beschreven in de referenties 18, 23 en 24) zijn. Met deze methode fluorescent gelabelde cellen, hetzij expressie fluorescerende eiwitten of immunologisch gekleurd voor oppervlakte markers, kan worden gezuiverd door FACS of door flow cytometrie geanalyseerd. RNA kan worden geëxtraheerd uit gezuiverde cellen hun genexpressiepatroon profiel. Als alternatief kunnen gezuiverde cellen worden gekweekt om een cellijn voor daaropvolgende proteomics analyse vast te stellen. Deze methode zal de karakterisatie van factoren e inschakelenxpressed door de alvleesklier micro-omgeving, die zijn organogenese, fysiologie en pathofysiologie regeren.
De pancreas mesenchym ondersteunt weefsel organogenese door het bevorderen van de verspreiding van precursoren en gedifferentieerde cellen 5, 9. Deze cellen werden getoond aan de expansie van menselijke embryonale stamcellen te ondersteunen (hESC) -afgeleide alvleesklier voorlopercellen 17, 25, 26. Daarom afbakening van de identiteit van embryonale mesenchymale factoren zou de huidige inspanningen om insuline producerende beta-cellen van hESCs en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) als een mogelijke behandeling van diabetes genereren vergemakkelijken. Muis genetisch onderzoek leidde tot de identificatie van groeifactoren, zoals Fgf10, die worden geproduceerd door de pancreas mesenchym epitheel expansie bevorderen tijdens de vroege stadia van ontwikkeling van de pancreas3, 9. Met als doel het identificeren van bijkomende factoren tot expressie gebracht in embryonale mesenchym, die we deze cellen met behulp van laser gevangen microdissectie, geëxtraheerd hun RNA en uitgevoerd genexpressieanalyse 26. Echter, naast het feit arbeidsintensief Deze werkwijze berust op het identificeren van cellen op basis van morfologische kenmerken die het gebruik ervan ontwikkelingsstadia vóór de vertakking van het epitheel in het omringende mesenchym (dwz E12.5) beperkt. Mesenchymale cellen te karakteriseren in latere ontwikkelingsstadia, gebruikten we de werkwijze hier 5, 17 beschreven.
We gebruikten deze methode om oppervlakte marker expressie te analyseren door neonatale pancreas mesenchym 5. Bovendien werden mesenchymale cellen geïsoleerd uit embryonale en neonatale pancreas weefsel van Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP muizen, op basishun fluorescerende labeling in deze muis lijn, en werden gekweekt cellijnen 17 vast te stellen. Het proteomische analyse van deze cellen toegestaan voor de identificatie van factoren afgescheiden door de alvleesklier mesenchym met het vermogen om hESC afgeleide pancreatische voorlopercellen 17 bevorderen. Verder hebben we gebruik gemaakt van deze cel isolatie methode om mesenchymale cellen te zuiveren van volwassen pancreas weefsels voor RNA-extractie en analyse van genexpressie 17. Daarom kan deze methode worden gebruikt om genen en eiwitten door de pancreas mesenchym uitgedrukt identificeren, met de mogelijkheid om pancreatische cel ontwikkeling te ondersteunen.
Pancreatische mesenchymale cellen werden verder aangetoond dat het een rol spelen pancreas tumorgenese. PDAC wordt gekenmerkt door de vorming van een fibroblast-rijke desmoplastisch stroma bestaat uit fibroblasten, immuuncellen en ECM 27. Terwijl de stroma werd gedacht dat de ontwikkeling van vele bevorderensoorten kanker, werd aangetoond dat progressie PDAC 15, 16, 28 beperken. Dit suggereert dat de onderdelen van de alvleesklier scheiden stroma factoren die tumorigenese te remmen. Bovendien veranderingen in stroma cellulaire samenstelling alsook in cel fenotype effect ervan ten grondslag liggen aan epitheliale cellen 15, 16, 28. De hier beschreven methode kan daarom helpen bij het karakteriseren van de verschillende soorten cellen die deel uitmaken van een PDAC stroma in vergelijking met gezonde pancreas weefsel. Het zou verder mogelijk de zuivering van de verschillende types stromale cellen om mogelijke veranderingen in de genexpressieprofielen te karakteriseren in PDAC progressie. Echter, als gevolg van veranderingen in de pancreas ECM samenstelling tijdens tumorigenese 27, aanpassingen van het weefsel verteringsparameters, zoals het opnemen van Additional types collagenase of verhogen van de incubatietijd, nodig zijn.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |