A continuación, describimos un método para el aislamiento de células en el microambiente de páncreas, tejido de ratón neonatal y adulto embrionario, centrándose en el aislamiento de las células mesenquimales. Este método permite que los perfiles de expresión génica de células y la secreción de proteínas con el fin de dilucidar las señales extrínsecas que regulan el desarrollo del páncreas, la función y la tumorigénesis.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
homeostasis de la energía y la digestión de alimentos en los mamíferos dependen de la función pancreática adecuada. El páncreas adulto se compone de dos principales compartimentos celulares: la exocrino y endocrino. Células exocrinas, incluyendo las células acinares que producen y secretan enzimas digestivas y las células de los conductos que transportan estas enzimas en el estómago, abarcan más de 80% de la masa pancreática total 1. Células endocrinas, que incluyen las células beta productoras de insulina y glucagón células alfa productoras, se organizan en los islotes de Langerhans que están incrustados en el tejido exocrino y secretan hormonas para regular los niveles de glucosa en la sangre 2.
Células pancreáticas adquieren su destino a través de una diferenciada, proceso de varios pasos altamente regulada 3. La evidencia sugiere que las señales extrínsecas proporcionadas por neuronal, endotelial, y las células mesenquimales guían la diferenciación de células de páncreas y la proliferación en tél embrión 3, 4, 5. Un ejemplo es el requisito de la aorta para la especificación de precursores tempranos pancreáticas 6. Más tarde en el desarrollo, se demostró que las células endoteliales para jugar un papel central en el desarrollo de ambas células endocrinas y exocrinas pancreáticas y para promover la diferenciación de las células beta 4, 6, 7. Se demostró que las células mesenquimales para apoyar la supervivencia y expansión de células progenitoras pancreáticas comunes, principalmente a través de la secreción del factor de crecimiento Fgf10 8, 9. Además, hemos demostrado que estas células apoyan la proliferación de endocrinas y exocrinas precursores, así como de las células diferenciadas (incluyendo las células acinares y beta) en el páncreas embrionario 5. Recientemente, células mesenquimales eran másdemostrado que regulan la diferenciación de las células endocrinas 10.
En el adulto, la función de las células beta y de masas se muestran a depender de las células en su microentorno, incluyendo neuronal, inmune, y las células endoteliales, así como los pericitos 11, 12, 13. Durante la lesión, se mostró que las células endoteliales para reclutar células inmunes al páncreas para promover la replicación de las células beta 13. Las células endoteliales se muestran adicionalmente para producir componentes de la matriz extracelular (ECM) para apoyar la expresión de insulina y de las células beta función 14. Recientemente hemos demostrado el requisito de pericitos de los islotes para la función de las células beta 11. Por último, se demostró que las células del estroma de páncreas para regular la progresión de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) 15, 16. Sin embargo, el identidad de señales extrínsecas que guían el desarrollo del páncreas, la función y la tumorigénesis son en gran parte desconocidos.
La identificación de las señales proporcionadas por las células del microambiente páncreas requiere la caracterización de los genes y las proteínas expresadas por estas células. Esto depende de aislamiento de estas células del páncreas en orden para llevar a cabo la expresión génica y análisis proteómicos y / o en el establecimiento de líneas celulares. Aquí, se propone un método para aislar células mesenquimales del microambiente páncreas mediante la utilización de la digestión enzimática del tejido y de fluorescencia de células activadas (FACS) de cualquiera de las células marcadas immunofluorescently-o células que expresan las proteínas fluorescentes. Este protocolo se realizó con éxito para aislar y analizar la proteína fluorescente amarilla (YFP) que expresan las células mesenquimales del embrionario, neonatal y adulto páncreas 5, 17.
Aquí, se describe un método para aislar y analizar las células del microambiente de páncreas. Este método se puede utilizar para aislar células mesenquimales de tejido pancreático embrionario y adulto. Además, hemos utilizado con éxito este protocolo para aislar células endoteliales de los adultos y el páncreas neonatal 5, 17. Sin embargo, puede no ser adecuado para la obtención de una suspensión de una sola célula reproducible de las células epiteliales pancreáticas (protocolos alternativos se describen en las referencias 18, 23, y 24). Usando este método, las células marcadas con fluorescencia, ya sea que expresan proteínas fluorescentes o inmunotinción para marcadores de la superficie, se puede purificar por FACS o analizado por citometría de flujo. ARN se puede extraer de las células purificadas al perfil de su patrón de expresión génica. Alternativamente, las células purificadas pueden ser cultivadas para establecer una línea de células para el análisis proteómico posterior. Este método permitirá a la caracterización de los factores expressed por el microambiente páncreas, que gobiernan su organogénesis, la fisiología y la fisiopatología.
El mesénquima de páncreas apoya la organogénesis de tejido mediante la promoción de la proliferación de precursores y células diferenciadas 5, 9. Se muestran estas células para apoyar la expansión de las células madre embrionarias (células madre) -derivado progenitores pancreáticos 17, 25, 26. Por lo tanto, la delimitación de la identidad de los factores mesenquimales embrionarias facilitaría los esfuerzos actuales para generar células beta productoras de insulina a partir de hESCs y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) como una cura potencial para la diabetes. Alfombrillas de estudios genéticos permitieron la identificación de factores de crecimiento, tales como Fgf10, que son producidos por el mesénquima para promover la expansión epitelio pancreático durante las primeras etapas del desarrollo del páncreas3, 9. Con el objetivo de identificar factores adicionales expresados en el mesénquima embrionario, aislamos estas células utilizando microdisección por láser capturado, se extrae su ARN, y realizó el análisis de la expresión génica 26. Sin embargo, además de ser de mano de obra intensa, este método se basa en la identificación de células en base a sus características morfológicas, lo que limita su uso a las etapas de desarrollo antes de la ramificación del epitelio en el mesénquima que rodea (es decir, E12.5). Para caracterizar las células mesenquimales en las etapas posteriores del desarrollo, hemos empleado el método descrito aquí 5, 17.
Se utilizó este método para analizar la expresión de marcadores de superficie por mesénquima pancreática neonatal 5. Además, se aislaron células mesenquimales de tejido pancreático embrionario y neonatal de Nkx3.2 -Cre; ratones R26-EYFP, basado ensu etiquetado fluorescente en esta línea de ratones, y se cultivaron para establecer líneas celulares 17. El análisis proteómico de estas células se permiten para la identificación de los factores segregados por el mesénquima de páncreas con la capacidad de promover progenitores pancreáticos de células madre derivadas de 17. Además, utiliza este método de aislamiento de células para purificar células mesenquimáticas de los tejidos pancreáticos adultos para la extracción de ARN y la expresión génica análisis 17. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para identificar los genes y las proteínas expresadas por el mesénquima de páncreas, con la capacidad de soportar el desarrollo de células de páncreas.
células mesenquimales pancreáticos se muestran más para jugar un papel en la tumorigénesis páncreas. PDAC se caracteriza por la formación de un estroma desmoplásico de fibroblastos rica compuesta de fibroblastos, células del sistema inmune, y ECM 27. Mientras que el estroma se considera que promueve el desarrollo de muchostipos de cáncer, se ha demostrado para frenar la progresión de la PDAC 15, 16, 28. Esto sugiere que los componentes del estroma de páncreas secretan factores que inhiben la tumorigénesis. Además, los cambios en la composición celular del estroma, así como en el fenotipo celular pueden ser la base de su efecto en las células epiteliales de 15, 16, 28. El método descrito aquí, por tanto, puede ayudar en la caracterización de los diferentes tipos de células que componen un estroma PDAC en comparación con tejido pancreático sano. Permitiría además la purificación de los diferentes tipos de células del estroma para caracterizar los cambios potenciales en sus perfiles de expresión génica durante la progresión del PDAC. Sin embargo, debido a los cambios en la composición de ECM de páncreas durante la tumorigénesis 27, los ajustes de los parámetros de digestión de tejido, tales como la inclusión de Additional tipos de colagenasa o aumentar el tiempo de incubación, puede ser requerida.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |