Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Enerji homeostasis ve memelilerde gıda sindirim düzgün pankreas fonksiyonuna bağlıdır. ekzokrin ve endokrin: yetişkin pankreas iki hücre bölümlerinde oluşmaktadır. Üreten ve salgılayan sindirim enzimleri ve gut, bu enzimleri taşıma kanalı hücreleri, toplam pankreas kütlesinin 1% 80'den fazlasını kapsayacak asiner hücreleri de dahil olmak üzere dış salgı hücreleri. Insülin üreten beta hücrelerini ve glukagon üreten alfa hücreleri bulunur endokrin hücreleri, ekzokrin dokusunda gömülü ve kan şekeri düzeylerini 2 düzenleyen hormonlar salgılar vardır Langerhans adacıkları düzenlenmektedir.
Pankreas hücreleri yüksek regüle, çok aşamalı süreç 3 aracılığıyla farklılaşmış kaderini kazanır. Kanıt nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler tarafından sağlanan dış ipuçları t pankreatik hücre farklılaşması ve çoğalması yol olduğunu göstermektedirEmbriyonun 3, 4, 5. Bir örnek erken pankreas öncüleri 6 özellikleri için aort gerekliliktir. Daha sonra bir gelişme olarak, endotel hücreleri, hem de pankreas salgı ve ekzokrin hücreleri gelişiminde önemli bir rol oynar ve beta hücre farklılaşması, 4, 6, 7 teşvik ettikleri gösterilmiştir. Mezenkimal hücreler esas büyüme faktörü FGF10 8, 9 salgılanması yoluyla, hayatta kalma ve ortak pankreas atalarıdır genişlemesini desteklemek gösterilmiştir. Biz ayrıca, bu hücreler, embriyonik pankreas 5 endokrin ve ekzokrin öncülerinin proliferasyonunu, hem de bir (asinar ve beta hücreleri dahil) farklılaşmış hücreleri destek göstermiştir. Son zamanlarda, mezenkimal hücreler, daha vardıendokrin hücreleri farklılaşmasını 10 düzenleyen gösterilmiştir.
Yetişkinde, beta hücresi işlevi ve kütle bağışıklık nöronal, ve endotelyal hücreler gibi perisitlerin 11, 12, 13 dahil olmak üzere, mikro-hücre bağlıdır gösterildi. Yaralanma sırasında endotel hücreleri beta hücresi çoğalmasını 13 desteklemek için pankreas bağışıklık hücreleri iyileştirme gösterildi. Endotel hücreleri daha insülin ekspresyonu ve beta hücresi fonksiyonunu 14 desteklemek için hücre dışı matris (ECM) bileşenleri üretmek için gösterildi. Biz son zamanlarda beta hücre fonksiyonu 11 adacık perisitlerin gereksinimi gösterdi. Son olarak, pankreas stroma hücreleri, pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 15, 16 ve ilerlemesini düzenleyen gösterildi. Bununla birlikte, kimlikPankreas geliştirme, fonksiyon ve tümörogenez rehberlik dışsal ipuçlarını işletmenin büyük ölçüde bilinmemektedir.
pankreas mikro-hücreleri tarafından sağlanan ipuçları belirlenmesi, bu hücreler tarafından ifade edilen genleri ve proteinleri karakterize gerektirir. Bu ve / veya hücre hatları kurma gen ekspresyonunu ve proteomik analizlerini gerçekleştirmek için pankreastan bu hücrelerin izole edilmesi bağlıdır. Burada, floresan proteinleri ifade immunofluorescently-işaretli hücrelerin veya hücre ya sıralama doku, enzimatik sindirim ve floresans ile aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılarak pankreas mikro mezenşimsel hücrelerde izole etmek için bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, başarılı bir şekilde, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas 5, 17, mezenkimal hücreler izole ve sarı floresan protein (YFP) -expressing analiz gerçekleştirilmiştir.
Burada, biz izole etmek ve pankreas mikroçevresinin hücreleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, embriyonik ve yetişkin pankreas dokusundan mezenkimal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde yetişkin ve yeni doğan pankreas 5, 17 endotel hücreleri izole etmek için bu protokolü kullanılmıştır. Bununla birlikte, (alternatif protokoller 24 Kaynaklar 18, 23 tarif edilen ve edilmiştir) pankreas epitel hücreleri tekrar üretilebilir bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için uygun olmayabilir. Bu yöntem, floresan etiketli hücreler kullanılarak ya floresan proteinleri ifade eden ya da yüzey belirteçleri için boyanmış, FACS ile saflaştınldı ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA gen sentezleme modelini profil saflaştırılmış hücrelerinden elde edilebilir. Alternatif olarak, saflaştırılmış hücreler, daha sonra proteomik analizi için bir hücre çizgisi oluşturmak için kültürlenebilir. Bu yöntem, faktör D karakterizasyonu sağlayacaktıronun organogenesis, fizyoloji ve patofizyolojisi yöneten pankreas mikro-tarafından xpressed.
Pankreatik mezenşimin öncüleri ve farklı hücreler 5, 9 çoğalmasını teşvik doku organogenez destekler. Bu hücreler, insan embriyonik kök hücre büyümesini desteklemek gösterilmiştir (hESC) pankreas atalarıdır 17, 25, 26 -türevlenmiş. Bu nedenle, embriyonik mezenşimal faktörleri kimliğini belirleyen HESC ve diyabet için potansiyel bir tedavi olarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) insülin üreten beta hücrelerinin üretilmesi için mevcut çabalar kolaylaştıracaktır. Fare genetik çalışmalar pankreas gelişiminin erken evrelerinde pankreas epitel genişleme teşvik etmek mezenşimin tarafından üretilen gibi FGF10 gibi büyüme faktörleri, tanımlanmasını izin3, 9. Embriyonik mezenşimin ifade ek faktörlerin belirlenmesi amacıyla, biz, lazer yakalanan mikrodiseksiyon kullanarak bu hücrelerin izole onların RNA ayıklanır ve gen ifadesi analizi 26 seslendirdi. Bununla birlikte, emek-yoğun bir olmanın yanı sıra, bu yöntem, önceden çevre mezenşim (yani, E12.5) içerisine epitel dallanma gelişim aşamalarına kullanımını kısıtlar morfolojik özellikleri, temel hücrelerin belirlenmesi dayanır. Daha sonra gelişim aşamalarında mezenkimal hücreler karakterize etmek için, biz burada 5, 17 açıklanan yöntemi kullanılmıştır.
Biz yenidoğan pankreas mezenşimin 5 yüzey işaretleyici ifade analiz etmek için bu yöntem kullanılır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler, Nkx3.2 -Cre embriyonik ve neonatal pankreas dokusundan izole edilmiştir; R26-EYFP fareler görefluoresan bu fare hattı etiketleme ve hücre çizgileri 17 kurmak için kültürlendi. HESC türetilen pankreas progenitörlerin 17 desteklemek için yeteneği ile pankreas mezenşimin salgılanan faktörlerin tanımlanması için izin verilen bu hücrelerin proteomik analizi. Biz daha RNA ekstraksiyon ve gen ekspresyon analizi 17 yetişkin pankreas dokulardan mezenkimal hücreler arındırmak için bu hücre izolasyon yöntemi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu yöntem, pankreatik hücre gelişimini desteklemek için yeteneği, pankreas mezenşim ile ifade edilen genleri ve proteinleri tanımlamak için kullanılabilir.
Pankreas mezenkimal hücreler daha pankreas tümörü oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. PDAC fibroblastlar, bağışıklık hücreleri içeren bir fibroblast zengin desmoplastik stroma oluşumu ve ECM 27 ile karakterize edilir. Stroma çok gelişmesini teşvik etmek düşünce ikenkanser türleri, o PDAC ilerlemesini 15, 16, 28 sınırlamaya gösterilmiştir. Bu pankreas stroma bileşenleri tümörogenez inhibe eden faktörleri salgılar düşündürmektedir. Ayrıca, stroma hücre bileşimin hem de hücre fenotipinde bir değişiklik epitel hücreleri 15, 16, 28 üzerindeki etkisinin altında olabilir. Burada tarif edilen yöntem, bu nedenle, sağlıklı pankreas dokusu ile karşılaştırıldığında PDAC stroma oluşturan farklı hücre tipleri karakterize yardımcı olabilir. Bundan başka, farklı bir stromal hücre tiplerinin saflaştırma PDAC ilerlemesi sırasında gen ekspresyon profillerinin potansiyel karakterize etmek izin verir. Ancak, tümörogenez 27 sırasında pankreas ECM bileşimindeki değişikliklere, bu tür addit dahil olarak doku sindirim parametrelerinin ayarlamaları,uğratarak kollajenaz tip ya da kuluçka süresini arttırmak gerekli olabilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |