अलग और प्रवाह cytometry द्वारा अग्न्याशय mesenchyme की कोशिकाओं का विश्लेषण
Summary
यहाँ, हम भ्रूण, नवजात और वयस्क माउस ऊतकों से अग्न्याशय microenvironment में कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन, mesenchymal कोशिकाओं के अलगाव पर ध्यान दे। इस विधि के आदेश बाह्य संकेत है कि अग्न्याशय विकास, समारोह, और tumorigenesis विनियमित स्पष्ट करने में सेल जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन का स्राव की प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।
Abstract
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Introduction
ऊर्जा homeostasis और स्तनधारियों में भोजन पाचन उचित अग्नाशय समारोह पर निर्भर करते हैं। बहि और अंत: स्रावी: वयस्क अग्न्याशय दो मुख्य सेलुलर डिब्बों के शामिल है। बहि कोशिकाओं, कोष्ठकी कोशिकाओं है कि उत्पादन और, पाचक एंजाइम और डक्ट कोशिकाओं है कि पेट के लिए इन एंजाइमों परिवहन छिपाना कुल अग्नाशय बड़े पैमाने पर 1 से 80% से अधिक धरना भी शामिल है। अंत: स्रावी कोशिकाओं है, जो इंसुलिन के उत्पादन बीटा कोशिकाओं और ग्लूकागन उत्पादक अल्फा कोशिकाओं में शामिल हैं, Langerhans की islets कि बहि ऊतक में एम्बेडेड और हार्मोन स्रावित रक्त शर्करा की मात्रा 2 विनियमित करने के लिए कर रहे हैं में आयोजित कर रहे हैं।
अग्नाशय कोशिकाओं को एक अत्यधिक विनियमित, multistep प्रक्रिया 3 के माध्यम से अपने विभेदित भाग्य का अधिग्रहण। सबूत बताते हैं कि न्यूरोनल, endothelial, और mesenchymal कोशिकाओं द्वारा प्रदान की बाह्य संकेतों अग्नाशय सेल भेदभाव और टी में प्रसार मार्गदर्शनवह भ्रूण 3, 4, 5। एक उदाहरण जल्दी अग्नाशय व्यापारियों 6 के विनिर्देश के लिए महाधमनी की आवश्यकता है। विकास में बाद में, endothelial कोशिकाओं दोनों अग्नाशय अंत: स्रावी और बहि कोशिकाओं के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए और बीटा सेल भेदभाव 4, 6, 7 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। Mesenchymal कोशिकाओं मुख्य रूप से वृद्धि कारक Fgf10 8, 9 के स्राव के माध्यम से, अस्तित्व और आम अग्नाशय progenitors के विस्तार का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है। हम आगे कहा कि इन कोशिकाओं को भ्रूण अग्न्याशय 5 में अंत: स्रावी और बहि व्यापारियों के प्रसार के साथ-साथ की विभेदित कोशिकाओं (कोष्ठकी और बीटा कोशिकाओं सहित) का समर्थन दिखाया है। हाल ही में, mesenchymal कोशिकाओं आगे थेअंत: स्रावी कोशिकाओं भेदभाव 10 विनियमित करने के लिए दिखाया गया है।
वयस्क में, बीटा सेल समारोह और बड़े पैमाने पर उनकी microenvironment में कोशिकाओं, न्यूरोनल, प्रतिरक्षा, और endothelial कोशिकाओं, साथ ही pericytes 11, 12, 13 सहित पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है। चोट के दौरान, endothelial कोशिकाओं अग्न्याशय के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती करने के लिए बीटा सेल प्रतिकृति 13 बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। Endothelial कोशिकाओं आगे इंसुलिन अभिव्यक्ति और बीटा सेल समारोह 14 समर्थन करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। हमने हाल ही में बीटा सेल समारोह 11 के लिए आइलेट pericytes की आवश्यकता का प्रदर्शन किया। अन्त में, अग्नाशय स्ट्रोमा की कोशिकाओं अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) 15, 16 की प्रगति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, आईडीकि मार्गदर्शन अग्न्याशय विकास, समारोह, और tumorigenesis बाह्य संकेतों की इकाई काफी हद तक अनजान रहे हैं।
अग्न्याशय microenvironment की कोशिकाओं द्वारा प्रदान संकेतों की पहचान जीन और प्रोटीन इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त निस्र्पक की आवश्यकता है। इस क्रम में और / या सेल लाइनों की स्थापना पर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक विश्लेषण प्रदर्शन करने में अग्न्याशय से इन कोशिकाओं को अलग करने पर निर्भर करता है। यहाँ, हम एक विधि का प्रस्ताव या तो immunofluorescently लेबल की कोशिकाओं या कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की ऊतक enzymatic पाचन और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के उपयोग से अग्न्याशय microenvironment के mesenchymal कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अलग और, भ्रूण नवजात, और वयस्क अग्न्याशय 5, 17 की mesenchymal कोशिकाओं पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) -expressing विश्लेषण करने के लिए किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम अलग और अग्नाशय microenvironment की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि भ्रूण और वयस्क अग्नाशय के ऊतकों से mesenchymal कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक वयस्क और नवजात अग्न्याशय 5, 17 से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। हालांकि, यह (वैकल्पिक प्रोटोकॉल संदर्भ में 18, 23 में वर्णित हैं, और 24) अग्नाशय उपकला कोशिकाओं की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। इस विधि, fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग करना, या तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त या सतह मार्करों के लिए immunostained, FACS द्वारा शुद्ध या प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। आरएनए उनके जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रोफ़ाइल करने के लिए शुद्ध कोशिकाओं से निकाला जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध कोशिकाओं बाद प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक सेल लाइन स्थापित करने के लिए संवर्धित किया जा सकता। इस विधि के कारकों ई लक्षण वर्णन सक्षम हो जाएगाअग्न्याशय microenvironment, जो अपनी जीवोत्पत्ति, शरीर विज्ञान, और pathophysiology शासन द्वारा xpressed।
अग्नाशय mesenchyme व्यापारियों और विभेदित कोशिकाओं 5, 9 के प्रसार को बढ़ावा देने से ऊतक जीवोत्पत्ति समर्थन करता है। इन कोशिकाओं को मानव भ्रूण स्टेम सेल के विस्तार का समर्थन करने के लिए दिखाया गया (hESC) अग्नाशय पूर्वज 17, 25, 26 व्युत्पन्न। इसलिए, भ्रूण mesenchymal कारकों की पहचान की रूपरेखा hESCs और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) मधुमेह के लिए एक संभावित इलाज के रूप से इंसुलिन के उत्पादन बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए वर्तमान प्रयासों की सुविधा होगी। माउस आनुवंशिक अध्ययन अग्न्याशय के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान अग्नाशय उपकला विस्तार को बढ़ावा देने के लिए इस तरह Fgf10 रूप में वृद्धि कारकों, कि mesenchyme द्वारा उत्पादित कर रहे हैं की पहचान की अनुमति दी3, 9। भ्रूण mesenchyme में व्यक्त अतिरिक्त कारकों की पहचान करने के उद्देश्य के साथ, हम इन लेजर कब्जा कर लिया microdissection का उपयोग कोशिकाओं को अलग किया है, उनके लिए शाही सेना निकाली गई, और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के 26 प्रदर्शन किया। हालांकि, श्रम तीव्र होने के अलावा, इस विधि को अपने रूपात्मक सुविधाओं, जो पूर्व के आसपास mesenchyme (यानी, E12.5) में उपकला की शाखाओं को विकास के चरणों के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है के आधार पर कोशिकाओं की पहचान पर निर्भर करता है। बाद में विकास के चरणों में mesenchymal कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, हम विधि यहाँ 5, 17 में वर्णित कार्यरत हैं।
हम इस विधि का इस्तेमाल नवजात अग्नाशय mesenchyme 5 से सतह मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए। इसके अलावा, mesenchymal कोशिकाओं Nkx3.2 -Cre की भ्रूण और नवजात अग्नाशय के ऊतकों से अलग थे; R26-EYFP चूहों पर आधारितइस माउस लाइन में अपने फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और सेल लाइनों की स्थापना के लिए 17 सुसंस्कृत थे। इन कोशिकाओं hESC व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वज 17 बढ़ावा देने की क्षमता के साथ अग्नाशय mesenchyme द्वारा स्रावित कारकों की पहचान के लिए अनुमति की प्रोटिओमिक विश्लेषण। हम आगे शाही सेना निष्कर्षण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 17 के लिए वयस्क अग्नाशय के ऊतकों से mesenchymal कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए इस सेल अलगाव विधि का इस्तेमाल किया। इसलिए, इस विधि अग्नाशय सेल के विकास का समर्थन करने की क्षमता के साथ जीन और प्रोटीन अग्नाशय mesenchyme द्वारा व्यक्त की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
अग्नाशय mesenchymal कोशिकाओं आगे अग्न्याशय tumorigenesis में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। PDAC एक fibroblast अमीर desmoplastic fibroblasts, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शामिल स्ट्रोमा के गठन, और ईसीएम 27 की विशेषता है। स्ट्रोमा कई के विकास को बढ़ावा देने के बारे में सोचा था, जबकिकैंसर के प्रकार, यह PDAC प्रगति 15, 16, 28 को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया था। यह पता चलता है कि अग्नाशय स्ट्रोमा के घटकों कारक है कि tumorigenesis बाधित छिपाना। इसके अलावा, स्ट्रोमा सेलुलर संरचना में और साथ ही सेल phenotype में परिवर्तन उपकला कोशिकाओं 15, 16, 28 पर उनके प्रभाव कायम कर सकते हैं। विधि यहाँ वर्णित इसलिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं है कि एक PDAC स्ट्रोमा को बनाने के स्वस्थ अग्नाशय के ऊतकों की तुलना में निस्र्पक में सहायता कर सकते हैं। इसे आगे भी विभिन्न प्रकार के stromal सेल की शुद्धि PDAC प्रगति के दौरान उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में संभावित परिवर्तनों को चिह्नित करने की अनुमति होगी। हालांकि, tumorigenesis 27 के दौरान अग्नाशय ईसीएम संरचना में परिवर्तन की वजह से, इस तरह के addit के शामिल किए जाने के रूप में ऊतक पाचन मापदंडों का समायोजन,ional कोलैजिनेज़ प्रकार या ऊष्मायन समय बढ़ रही है, आवश्यक हो सकता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
| Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
| L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
| 1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
| Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
| 5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
| 70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
| Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
| flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).
- Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. , 1-8 (2012).
- Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
- Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).
- Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).
- Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).
- Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).
- Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).
- Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).
- Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).
- Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).
- Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).
- Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).
- Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).
- Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).
- Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).
- Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9 (5), 95486 (2014).
- Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).
