Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering av celler i bukspyttkjertelen mikromiljøet fra embryoniske, neonatale og voksne mus vev, med fokus på isolering av mesenchymale celler. Denne metoden gjør det mulig profilering av celle genekspresjon og protein sekresjon for å belyse de ytre signalene som regulerer bukspyttkjertel utviklingen, funksjon og tumorigenesis.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Energi homeostase og fordøyelsen hos pattedyr er avhengig av riktig bukspyttkjertelfunksjon. Den voksne bukspyttkjertelen består av to hoved cellulære avdelinger: eksokrin og endokrin. Eksokrine celler, inkludert akinærceller som produserer og utskiller fordøyelsesenzymer og de kanalsystem celler som transporterer disse enzymene til tarmen, omfatte mer enn 80% av den totale massen pancreatic 1. Endokrine celler, som inkluderer insulinproduserende betaceller og glukagon-produserende alfaceller, er organisert i de Langerhanske øyer som er innebygd i den eksokrine vevet og skiller ut hormoner for å regulere blodsukkernivået 2.
Bukspyttkjertelen celler skaffe sin differensiert skjebne gjennom en svært regulert, flertrinnsprosess tre. Tyder på at ytre signaler gitt av nevronale, endothelial, og mesenchymalceller veilede bukspyttkjertelen celledifferensiering og spredning i than embryo 3, 4, 5. Et eksempel er kravet til aorta for spesifisering av tidlige forløpere pankreatiske 6. Senere i utvikling, ble endotelceller vist seg å spille en sentral rolle i utviklingen av både bukspyttkjertelen endokrine og eksokrine celler og for å fremme beta-celledifferensiering 4, 6, 7. Mesenchymale celler ble vist å understøtte overlevelsen og utvidelse av vanlige pankreas progenitorceller, hovedsakelig gjennom sekresjon av vekstfaktor Fgf10 8, 9. Vi har videre vist at disse cellene understøtte proliferasjon av endokrine og eksokrine forløpere, samt av differensierte celler (inkludert acinar og beta-celler) i den embryoniske bukspyttkjertelen 5. Nylig mesenchymalceller var viderevist seg å regulere endokrine celler differensiering 10.
I den voksne, ble beta-cellefunksjon og masse vist seg å være avhengig av celler i deres mikromiljø, innbefattet nerve-, immunsystemet, og endotelceller, samt pericytes 11, 12, 13. I løpet av skade, ble endotelceller vist å rekruttere immunceller til bukspyttkjertelen for å fremme beta-celle-replikasjon 13. Endotelceller ble videre vist å produsere ekstracellulær matriks (ECM) komponenter for å støtte insulin ekspresjon og beta-cellefunksjon 14. Vi har nylig demonstrert kravet om holmen pericytes for betacellefunksjon 11. Til slutt, ble cellene i bukspyttkjertelen stroma vist seg å regulere utviklingen av pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC) 15, 16. Imidlertid idenhet av ytre signaler som styrer bukspyttkjertelen utvikling, funksjon og tumorigenesis er i stor grad ukjent.
Identifisering av signaler levert av cellene i bukspyttkjertelen mikromiljøet krever karakterisering av genene og proteinene uttrykt av disse celler. Dette er avhengig av å isolere disse cellene fra bukspyttkjertelen for å utføre genekspresjon og proteomic analyser og / eller å etablere cellelinjer. Her, foreslår en metode for å isolere mesenchymale celler i bukspyttkjertelen mikromiljøet ved å benytte vev enzymatisk fordøyelse og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) av enten immunofluorescently-merkede celler eller celler som uttrykker fluorescerende proteiner. Denne protokollen ble vellykket utført for å isolere og analysere gul fluoriserende protein (YFP) -expressing mesenchymale celler av embryonale, neonatal, og voksen bukspyttkjertelen 5, 17.
Her beskriver vi en metode for å isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen mikromiljøet. Denne fremgangsmåten kan brukes til å isolere mesenchymale celler fra embryonisk og voksen pankreatisk vev. I tillegg har vi med hell brukt denne protokollen for å isolere endotelceller fra den voksne og neonatal bukspyttkjertelen 5, 17. Det kan imidlertid ikke være egnet til å oppnå en reproduserbar enkeltcellesuspensjon av pankreas epitelceller (alternative protokoller er beskrevet i referanser 18 og 23, og 24). Ved hjelp av denne metode, fluorescensmerket-merkede celler, som uttrykker enten fluorescerende proteiner eller immunfarget for overflatemarkører, kan renses ved hjelp av FACS og analysert ved strømningscytometri. RNA kan ekstraheres fra rensede celler for å profilere deres genekspresjon mønster. Alternativt kan renset celler dyrkes for å etablere en cellelinje for påfølgende proteomikk analyse. Denne metoden gjør det mulig å karakterisere faktorer expressed av bukspyttkjertelen mikromiljøet, som styrer sin organogeneseperioden, fysiologi og patofysiologi.
Bukspyttkjertelen mesenchyme støtter vev organogeneseperioden ved å fremme spredning av forløpere og differensierte celler 5, 9. Disse cellene ble vist seg å støtte utvidelsen av humane embryonale stamceller (hESC) avledede bukspyttkjertelen stamfedre 17, 25, 26. Derfor opptegning identiteten til embryonale mesenchymale faktorer vil lette dagens innsats for å generere insulinproduserende betaceller fra hESCs og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) som en potensiell kur for diabetes. Muse genetiske studier tillot identifisering av vekstfaktorer, slik som Fgf10, som er produsert ved den mesenchyme for å fremme pankreatisk epitel ekspansjon i løpet av den tidlige fasen av bukspyttkjertel utvikling3, 9. Med mål om å identifisere flere faktorer uttrykt i embryonale mesenchyme, isolert vi disse cellene ved hjelp av laser-fanget mikrodisseksjon, hentet sin RNA, og utført genekspresjonsanalyser 26. Imidlertid, i tillegg til å være arbeidskrevende, Denne metoden kan bare å identifisere celler basert på deres morfologiske egenskaper, noe som begrenser bruken til utviklingsstadier før forgreningen av epitelet i det omkringliggende mesenchyme (dvs. E12.5). For å karakterisere mesenchymalceller på senere utviklingsstadier, ansatt vi metoden beskrevet her 5, 17.
Vi brukte denne metoden til å analysere overflaten markør uttrykk ved neonatal bukspyttkjertelen mesenchyme 5. I tillegg ble mesenchymale celler isolert fra embryoniske og neonatal pankreatisk vev fra Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP mus, på grunnlag avderes fluorescerende merkingen i denne muselinje, og ble dyrket til å etablere cellelinjer 17. Den proteomikk analyse av disse cellene tillatt for identifisering av faktorer som utskilles av den pankreatiske mesenchyme med evnen til å fremme hESC-avledede stamceller pankreatiske 17. Vi videre brukt denne cellen isolasjon metoden for å rense mesenchymalceller fra voksne bukspyttkjertelen vev for RNA-ekstraksjon og analyse av genuttrykk 17. Derfor kan denne metoden anvendes for å identifisere genene og proteinene uttrykt av det pankreatiske mesenchyme, med evnen til å understøtte bukspyttkjertelen celle utvikling.
Pankreas mesenchymale celler ble videre vist å spille en rolle i bukspyttkjertel tumorigenesis. PDAC er karakterisert ved dannelse av en fibroblast-rik desmoplastic stroma består av fibroblaster, immunceller, og ECM 27. Mens stroma ble antatt å fremme utviklingen av mangetyper kreft, ble det vist å beherske PDAC progresjon 15, 16, 28. Dette tyder på at deler av bukspyttkjertelen stroma utskille faktorer som hemmer tumorigenesis. Videre kan forandringer i stroma cellulære sammensetning, så vel som i celle-fenotype ligger til grunn for deres virkning på epitelceller 15, 16, 28. Metoden som beskrives her kan derfor hjelpe til å karakterisere de forskjellige celletyper som utgjør en PDAC stroma sammenlignet med friske pankreas vev. Det ville videre tillate rensing av de forskjellige stromale celletyper for å karakterisere mulige endringer i deres genekspresjonsprofiler under PDAC progresjon. Men på grunn av forandringer i pankreas ECM sammensetning under tumorgenese 27, justeringer av vev fordøyelsen parametere, slik som inkludering av additional kollagenase-typer eller økning av inkubasjonstiden, kan være nødvendig.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |