Här beskriver vi en metod för isolering av celler i bukspottkörteln mikro från embryonala, neonatala och vuxna mus vävnad, med fokus på isolering av mesenkymala celler. Denna metod tillåter profilering av cell genuttryck och proteinutsöndring för att belysa de yttre signaler som reglerar bukspottkörteln utveckling, funktion, och tumörbildning.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Energi homeostas och matsmältningen hos däggdjur beroende av korrekt bukspottkörtelfunktion. Den vuxna bukspottkörteln består av två huvudsakliga cellulära avdelningar: den exokrina och endokrina. Exokrina celler, även de acinära celler som producerar och utsöndrar matsmältningsenzymer och de gångceller som transporterar dessa enzymer till tarmen, omfattar mer än 80% av den totala pankreasmassan 1. Endokrina celler, som omfattar insulinproducerande betaceller och glukagon producerande alfaceller, är organiserade i Langerhanska öar som är inbäddade i den exokrina vävnaden och utsöndrar hormoner för att reglera blodsockernivåer 2.
Pankreasceller förvärva deras differentierade öde genom en mycket reglerad, flerstegsprocess 3. Uppgifter tyder på att yttre signaler som tillhandahålls av neuronala, endotelceller, och mesenkymala celler vägleda pankreascelldifferentiering och proliferation i than embryo 3, 4, 5. Ett exempel är kravet på stora kroppspulsådern för att specificera början pankreas prekursorer 6. Senare under utveckling, har endotelceller visat sig spela en central roll i utvecklingen av både bukspottkörtelns endokrina och exokrina celler och för att främja betacelldifferentiering 4, 6, 7. Mesenkymala celler visade sig stödja överlevnad och expansion av gemensamma pankreas stamceller, främst genom utsöndring av tillväxtfaktorn Fgf10 8, 9. Vi har vidare visat att dessa celler stöder spridningen av endokrina och exokrina prekursorer, liksom av differentierade celler (inklusive körtel och betaceller) i den embryonala bukspottkörteln 5. Nyligen, mesenkymala celler var ytterligarevisat att reglera endokrina celler differentiering 10.
I den vuxna, var beta-cellfunktion och massa visat sig vara beroende av celler i deras mikromiljö, inklusive neuronal, immun och endotelceller, såväl som pericyter 11, 12, 13. Under skada, har endotelceller visat att rekrytera immunceller till bukspottkörteln att främja beta-cellreplikation 13. Endotelceller vidare visat att producera extracellulära matrix (ECM) komponenter för att stödja insulinuttryck och beta-cellfunktion 14. Vi visade nyligen kravet på ö pericyter för betacellsfunktionen 11. Slutligen har celler i bukspottskörteln stroma visade att reglera utvecklingen av bukspottkörtel duktal adenokarcinom (PDAC) 15, 16. Emellertid idenhet yttre signaler som styr bukspottkörteln utveckling, funktion, och tumörbildning är till stor del okända.
Identifiera ledtrådar som tillhandahålls av celler i bukspottkörteln mikromiljö kräver karakterisera gener och proteiner som uttrycks av dessa celler. Detta beror på att isolera dessa celler från bukspottkörteln för att utföra genuttryck och proteomik analyser och / eller på att etablera cellinjer. Här föreslår vi en metod för att isolera mesenkymala celler i bukspottkörteln mikromiljö genom att utnyttja vävnads enzymatisk digestion och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av antingen immunofluorescently-märkta celler eller celler som uttrycker fluorescerande proteiner. Detta protokoll genomfördes framgångsrikt för att isolera och analysera gul fluorescerande protein (YFP) uttryckande mesenkymala celler i embryonala, neonatala och vuxna bukspottkörteln 5, 17.
Här beskriver vi en metod för att isolera och analysera celler av den pankreatiska mikromiljö. Denna metod kan användas för att isolera mesenkymala celler från embryonal och adult pankreatisk vävnad. Dessutom har vi med framgång använt detta protokoll för att isolera endotelceller från vuxna och neonatal bukspottkörteln 5, 17. Emellertid kan det inte vara lämplig för att erhålla ett reproducerbart encelliga suspension av pankreatiska epitelceller (alternativa protokoll beskrivs i referenserna 18, 23 och 24). Med användning av denna metod, fluorescensmärkta celler, antingen som uttrycker fluorescerande proteiner eller immunfärgades för ytmarkörer, kan renas genom FACS eller analyserades med flödescytometri. RNA kan extraheras från renade celler för att profilera sin genuttryck mönster. Alternativt kan renade celler odlas för att etablera en cellinje för efterföljande proteomik analys. Denna metod gör det möjligt för karakterisering av faktorer expressed av bukspottkörteln mikromiljö, som reglerar dess organogenes, fysiologi och patofysiologi.
Pankreas mesenkym stödjer vävnadsorgan genom att främja spridningen av prekursorer och differentierade celler 5, 9. Dessa celler visade sig stödja utbyggnaden av mänskliga embryonala stamceller (hESC) härledda bukspottkörteln stamceller 17, 25, 26. Därför skulle avgränsar identitet embryonala mesenkymala faktorer underlätta pågående ansträngningarna att skapa insulinproducerande betaceller från hESCs och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som en potentiell bot för diabetes. Mus genetiska studier medgav identifiering av tillväxtfaktorer, såsom Fgf10, som produceras av mesenkym att främja pancreatic epitel expansion under de tidiga stadierna av bukspottkörteln utveckling3, 9. I syfte att identifiera ytterligare faktorer uttryckta i embryonala mesenkym, isolerade vi dessa celler med hjälp av laser fångade microdissection, extraherades deras RNA, och utförde genexpressionsanalys 26. Men förutom att vara arbetsintensiva, förlitar sig denna metod på att identifiera celler baserat på deras morfologiska egenskaper, vilket begränsar dess användning till utvecklingsstadier före förgreningen av epitelet in i den omgivande mesenkym (dvs., E12.5). För att karakterisera mesenkymala celler i senare utvecklingsstadier, använde vi den här beskrivna metoden 5, 17.
Vi använde denna metod för att analysera ytan markör uttryck av neonatal bukspottskörteln mesenkym 5. Dessutom har mesenkymala celler isolerade från embryonal och neonatal pankreatisk vävnad av Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP möss, baserat påderas fluorescensmärkning i denna mus linje, och odlades att etablera cellinjer 17. Den proteomik analys av dessa celler tillåts för identifiering av faktorer som utsöndras av pankreas mesenkym med förmåga att främja hESC-derived bukspottkörteln stamceller 17. Vi använde vidare denna cellisolering metod för att rena mesenkymala celler från vuxna pankreas vävnader för RNA-extraktion och genexpressionsanalys 17. Därför kan denna metod användas för att identifiera gener och proteiner som uttrycks av den pankreatiska mesenkym, med förmågan att stödja pankreatisk cellutveckling.
Pankreas mesenkymala celler vidare visat sig spela en roll i bukspottkörteln tumörbildning. PDAC kännetecknas av bildningen av en fibroblast-rika desmoplastic stroma består av fibroblaster, immunceller, och ECM 27. Medan stroma ansågs främja utvecklingen av mångatyper av cancer, visades det att hålla tillbaka PDAC progression 15, 16, 28. Detta tyder på att komponenterna i bukspottskörteln stroma utsöndrar faktorer som hämmar tumörbildning. Vidare kan förändringar i stroma cellulära sammansättning samt i cellfenotyp ligga bakom deras effekt på epitelceller 15, 16, 28. Den metod som beskrivs här kan därför bidra till att beskriva de olika celltyper som utgör en PDAC stroma jämfört med friska pankreasvävnad. Det skulle vidare tillåta reningen av de olika stromala celltyper för att karakterisera potentiella förändringar i deras genuttrycksprofilerna under PDAC progression. Men på grund av förändringar i bukspottskörteln ECM sammansättning under tumörbildning 27, justeringar av vävnad matsmältningen parametrar, såsom införandet av Additional kollagenas typer eller öka inkubationstiden, kan krävas.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |