Summary
I dette papiret presenteres en mikroprosess arbeidsflyt med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer, samt mitokondrielt membranpotensial og morfologi - i fellesskap referert til som mitokondriell morfofunksjon - i levende vedhengende celler ved bruk av celle-permeant fluorescerende reportermolekyler 5- (og- 6) -klorometyl-2 ', 7'-diklorodihydrofluoresceindiacetat, acetylester (CM-H2 DCFDA) og tetrametylrhodamin-metylester (TMRM).
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) regulerer viktige cellulære prosesser, inkludert genuttrykk, migrasjon, differensiering og proliferasjon. Overdrivende ROS-nivåer induserer imidlertid en tilstand av oksidativt stress, som er ledsaget av irreversibel oksidativ skade på DNA, lipider og proteiner. Dermed gir kvantifisering av ROS en direkte proxy for cellulær helse tilstand. Siden mitokondrier er en av de viktigste cellene og målene for ROS, er felles analyse av mitokondriell funksjon og ROS-produksjon i de samme cellene avgjørende for bedre forståelse av sammenkoblingen i patofysiologiske forhold. Derfor ble det utviklet en mikroskopibasert strategi med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer, mitokondrielt membranpotensial (ΔΨ m ) og mitokondriell morfologi. Den er basert på automatisert widefield fluorescensmikroskopi og bildeanalyse av levende vedhengende celler, dyrket i multi-brønnplater og staineD med de celle-permeable fluorescerende reportermolekylene CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (ΔΨ m og mitokondriellmorfologi). I motsetning til fluorometri eller strømningscytometri, tillater denne strategien kvantifisering av subcellulære parametere på nivået av den enkelte celle med høy spatiotemporal oppløsning, både før og etter eksperimentell stimulering. Viktig er at den bildebaserte karakteren av metoden tillater utvinning av morfologiske parametere i tillegg til signalintensiteter. Det kombinerte funksjonssettet brukes til explorativ og statistisk multivariativ dataanalyse for å oppdage forskjeller mellom subpopulasjoner, celletyper og / eller behandlinger. Her er en detaljert beskrivelse av analysen gitt sammen med et eksempeleksperiment som viser sitt potensial for entydig diskriminering mellom cellulære tilstander etter kjemisk forstyrrelse.
Introduction
Konsentrasjonen av intracellulær ROS reguleres omhyggelig gjennom et dynamisk samspill mellom ROS-produserende og ROS-defusing-systemer. Ubalanse mellom de to fremkaller en tilstand av oksidativt stress. Blant de store kildene til ROS er mitokondrier 1 . Gitt deres rolle i cellulær respirasjon, er de ansvarlige for størstedelen av intracellulære superoksid (O 2 • - ) molekyler 2 . Dette skyldes for det meste elektronelekkasje til O 2 i kompleks 1 av elektrontransportkjeden under betingelser med sterkt negativt indre mitokondrielt membranpotensial (ψψ m ), dvs. mitokondriell hyperpolarisering. På den annen side har mitokondriell depolarisering også vært korrelert med økt ROS-produksjon som peker på flere virkemåter 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Videre, gjennom redoks-modifikasjoner i proteiner i fissionsfusjonsmaskinen, regulerer ROS med mitokondriell morfologi 9. For eksempel er fragmentering korrelert med økt ROS-produksjon og apoptose 10 , 11 , mens filamentøse mitokondrier har vært knyttet til næringsstøt og beskyttelse mot Mitofagi 12 . Gitt det intrikate forholdet mellom cellulær ROS og mitokondriell morfofunksjon, bør begge ideelt sett kvantifiseres samtidig i levende celler. For å utføre dette, ble det utviklet et høyverdig bildebehandlingsassay basert på automatisert widefieldmikroskopi og bildeanalyse av adherente cellekulturer farget med fluorescerende prober CM-H 2 DCFDA (ROS) og TMRM (mitokondriell ψψm og morfologi). Høyinnholds bildebehandling refererer til utvinning av spAtiotemporalt rik ( dvs. stort antall beskrivende egenskaper) informasjon om cellulære fenotyper ved hjelp av flere komplementære markører og automatiserte bildeanalyser. Når kombinert med automatisert mikroskopi, kan mange prøver screenes parallelt ( dvs. høy gjennomstrømning), og dermed øke den statistiske effekten av analysen. Faktisk er et hovedelement i protokollen at det muliggjør samtidig kvantifisering av flere parametere i samme celle, og dette for et stort antall celler og forhold.
Protokollen er delt inn i 8 deler (beskrevet i detalj i protokollen nedenfor): 1) Seeding celler i en 96-brønn plate; 2) Fremstilling av stamløsninger, arbeidsløsninger og bildebuffer; 3) Oppsett av mikroskop; 4) Lading av cellene med CM-H2 DCFDA og TMRM; 5) Første levende bildebehandlingsrunde for å måle basale ROS-nivåer og mitokondriell morfofunksjon; 6) Andre levende bildebehandlingsrunde etter tilsetning av tert -butylPeroxide (TBHP) for å måle induserte ROS-nivåer; 7) Automatisk bildeanalyse; 8) Dataanalyse, kvalitetskontroll og visualisering.
Analysen ble opprinnelig utviklet for normale humane dermal fibroblaster (NHDF). Siden disse cellene er store og flate, er de godt egnet for å vurdere mitokondriell morfologi i 2D widefieldbilder 13 , 14 . Imidlertid, med mindre endringer, er denne metoden gjeldende for andre vedhengende celletyper. Videre følger arbeidsflyten ved siden av kombinasjonen av CM-H 2 DCFDA og TMRM en rekke fluorescerende fargepar med forskjellige molekylære spesifisiteter 1 , 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor er beskrevet som utført for NHDF-celler og ved bruk av multiwellplater spesifisert i materialefilen. Se Figur 1 for en generell oversikt over arbeidsflyten.
1. Fremstilling av reagenser
- Klargjør fullstendig medium ved å supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% v / v føtalt bovint serum (FBS) og 100 IE / ml penicillin og 100 IE / ml streptomycin (PS). Til 500 ml komplett medium tilsetter 50 ml FBS og 5 ml PS til 445 ml DMEM.
- Forbered HBSS-HEPES (HH) bildebuffer ved å supplere Hank Balanced Salt Solution (med magnesium og kalsium, men uten fenolrød) med 20 mM HEPES. For 500 ml HH, tilsett 10 ml 1 M HEPES stamløsning til 490 ml HBSS. Kontroller pH og juster om nødvendig til pH 7,2.
- Lag 1 mM CM-H2 DCFDA stamløsning ved å oppløse 50 μg CM-H2 DCFDA lyofilisert pulver i 86,5 &# 181; L vannfri DMSO. Bland ved vortexing eller pipettering opp og ned og lag 20 μl alikvoter i brune mikrocentrifugerør. Oppbevares i mørket ved -20 ° C og bruk innen 1 uke. Ved lagring under N 2- atmosfære kan holdbarheten økes i minst 1 måned.
- Lag 1 mM TMRM stamløsning ved å oppløse 25 mg TMRM pulver i 50 ml vannfri DMSO. Bland ved vortexing eller pipettering opp og ned og lag 10 μl alikvoter i brune mikrosentrifugerør. Oppbevares i mørket ved -20 ° C. Denne løsningen er stabil i minst et år.
- Klargjør en fersk alikvot av Tert -butylperoksid (TBHP) lager (~ 7 M) for hvert eksperiment ved å pipettere et volum direkte fra 70% stamløsningen (10 μl / 96 brønnplate). Oppbevar denne alikvoten ved 4 ° C til videre bruk.
- Forbered antistoff-arbeidsløsning (AB) ved å fortynne to sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488-esel-anti-kanin og CY3-esel-anti-kanin) 1000 ganger i 1x HH-buffer.
2. Oppsett av mikroskop og oppkjøpsprotokoll (± 15 min)
MERK: Bildeoppkjøpet utføres med et brettfeltmikroskop utstyrt med en automatisert scene og skodder, og et maskinbasert autofokus-system ved hjelp av et 20X luftplanrettet mål (NA = 0.75) og et EM-CCD kamera. Ved oppsett av analysen for første gang brukes en testplate som inneholder kontrollceller, farget i henhold til protokollens instruksjoner, til å kalibrere XY-scenen og for å optimalisere oppkjøpsinnstillingene. Hvis oppkjøpsinnstillingene allerede er bestemt, kan kalibreringen gjøres ved bruk av en tom plate.
- Senk målet til det absolutte grunnnivået og kalibrer XY-scenen som følger programvareinstruksjonene.
- Pass på at de riktige filterkubene er installert. For å visualisere CM-H 2 DCFDA, bruk en standard GFP filterkube med et 472/30 nm excitasjon bandpassfilter, en 495 nm cutoff dichroIc-speil og et 520/35 nm bandpass-utslippsfilter. For TMRM, bruk en filterkube for TRITC med et 540/25 nm bandpass-eksitasjonsfilter, et 565 nm cutoff dikroisk speil og et 605/55 nm bandpass-utslippsfilter.
- Opprett en bildebehandlingsprotokoll ved hjelp av oppkjøpsprogramvaren.
- Velg riktig type multiwellplate (produsent og kode) fra listen over tilgjengelige plater som finnes i programvaren. Alternativt kan du definere ditt eget multiwell plateformat ved hjelp av tallerken og brønndimensjoner.
- Juster brønnplaten i henhold til programvareens instruksjoner, for eksempel ved å definere to hjørner av de fire ytre hjørnebrønnene. Dette trinnet dekker for variasjon av kameraorientering.
- Velg brønnene som må kjøpes. Hvis dette alternativet ikke er tilgjengelig i programvaren, bruker du et sett med manuelt definerte XY-steder som samsvarer med de valgte brønnene.
- Optimaliser oppkjøpsinnstillingene (eksponeringstid, lampens intensitet, EM-gain) for thE to kanaler separat ved hjelp av testplaten. Minimer eksponering og intensitet som fluorescens-eksitasjonslampe selv induserer ROS. Men sørg for at signalet til bakgrunnsforholdet er minst 2 for basal CM-H 2 DCFDA og 3 for TMRM før TBHP-behandling, og at det ikke er noen metning etter TBHP-behandling. Oppkjøpsinnstillingene er i stor grad avhengig av mikroskopioppsettet og celletypen som brukes, men som referanse er det veiledende innstillinger ved bruk av en metallhalogenpære på 130 W som lyskilde og NHDF-celler som er farget i henhold til protokollens instruksjoner, som følger: for begge CM- H 2 DCFDA og TMRM brukes en eksponeringstid på 200 ms og ND filter 8, kombinert med en EM-forsterkning på henholdsvis 15 (13 MHz, 14-bit) og 4 (27 MHz, 14-bit). Når dette er optimalisert for en bestemt oppsett og celletype, kan dette trinnet hoppes over.
MERK: Det er viktig at oppkjøpsinnstillingene holdes de samme gjennom hele bildeprosessen. For store, fler-dagers eksperimenter, lampe staBility bør garanteres med regelmessig kvalitetskontroll. - Definer en oppkjøpsprotokoll, bestående av en sekvensiell lambda (bølgelengde) oppkjøp. Velg CM-H 2 DCFDA-kanalen som skal kjøpes først, for å minimere lyseksponering før måling.
- Definer en brønnplate sløyfe for å skaffe 4 regelmessige mellomrom som ikke er overlappende bilder plassert rundt midten av hver brønn i brønnsvalget ved hjelp av oppkjøpsprotokollen som er definert i 2.3.4. Velg forandrende bildeoppkjøp, dvs. først fra venstre til høyre, fra brønn B02 til B11, deretter tilbake, fra høyre til venstre, fra brønn C11 til C02 og så videre ( Figur 2A ). Dette sparer tid sammenlignet med venstre til høyre bildeoppkjøp. Hvis dette alternativet ikke er tilgjengelig i programvaren, må du justere det egendefinerte settet av XY-steder som er opprettet i 2.3.3 for å ta på dette bildebehandlingsmønsteret.
- Lagre XY-koordinatene til bildebehandlingsposisjonene ( f.eks. I en egen xml-fil), slik at det blir enkelt å revidereNg ved mikroskoprekalibrering. Dette er spesielt viktig hvis avlesningen fra denne analysen må korreleres med en post-hoc immunfluorescens (IF) -farging for de samme celler.
3 . Seeding Cells i en 96-brønn plate (45 - 90 min, avhengig av antall forskjellige cellelinjer)
- Arbeid i sterilt miljø som et klasse 2 biosikkerhetsskap og slitasjehansker.
- Dekontaminere alle overflater og materialer ved bruk av 70% v / v etanol i destillert vann.
- Ta en cellekulturflaske med en 90% konfluent cellekultur fra inkubatoren og plasser den i biosikkerhetsskapet.
- Vask cellene to ganger med PBS 1x.
- Legg til riktig mengde 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning på cellene, og kontroller at hele celleoverflaten er dekket ( f.eks . 1 ml for en T25-kolbe) og inkuber i 2 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Hvis alle cellene er frittliggende (kontroller med et mikroskop ), Tilsett kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin; ± 4 ml i en T25-kolbe) for å inaktivere trypsin-EDTA-oppløsningen.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspender cellepellet i dyrkningsmedium. Bestem mengden medium for hver celletype for å oppnå en cellekonsentrasjon som er kompatibel med celletelling. Vanligvis inneholder en 90% konfluent T25-kolbe av NHDF ca. 1-1,5 millioner celler, som resuspenderes i 3-4 ml dyrkningsmedium.
- Telle cellene ved hjelp av et celle tellerrom eller Coulter teller.
- Sæd 8 000-10 000 celler i hver av de indre 60 brønnene i en svart 96-brønn plate med en tynn, kontinuerlig polystyren eller glassbunn (svart for å unngå spredning og kryssprøve mellom tilstøtende brønner under avbildning). Når du bruker forskjellige forhold / behandlinger / cellelinjer, distribuere deres plantesteder homogent på platen for å minimere plateffekter (Fig. "> Figur 2A). Ytre brønner, unntatt brønn B01 og A01, brukes ikke fordi de er mer utsatt for kanteneffekter.
- Seed 8.000-10.000 celler i B01. Denne brønnen vil bli brukt til fokusjustering, like før bildetes oppkjøp.
- Fyll de tomme ytre brønnene med medium for å minimere gradienter (temperatur, fuktighet, etc. ) mellom brønnene og miljøet.
- Trekk forsiktig plate tre ganger før du legger den tilbake i inkubatoren for å unngå at celler vokser i flekker.
- Kultur cellene i 24 timer, eller opp til en konfluensgrad på ca. 70%.
- Lagre behandlingsinformasjonen for eksperimentet i et regneark kalt "Setup.xlsx". Filen skal inneholde fire kolonner og brukes til å knytte behandlinger med brønner og bildeinformasjon under dataanalyse. De fire kolonnene er: "Vel", "Behandlingsnummer", "Behandling" og "Kontroll" (en rad per brønn). Hver behandling er koblet sammenMed et unikt behandlingsnummer, som brukes under datavisualisering for å bestemme rekkefølgen av behandlingen på X-aksen av tomter. Kontroll-kolonnen spesifiserer behandlingen som fungerer som kontroll for behandlingen i den nåværende raden. Illustrasjoner av en typisk eksperimentell oppsett og tilsvarende oppsettfil er avbildet i figur 2 .
4. Lasting av cellene med CM-H 2 DCFDA og TMRM (± 45 min)
MERK: Håndtering av cellene på forsøksdagen kan utføres i et sterilt miljø (biosikkerhetsskap), men dette er ikke obligatorisk fordi celler vil bli kassert eller festet umiddelbart etter analysen.
- Varm HH-bufferen til 37 ° C.
- Forbered en 20 μM TMRM-arbeidsløsning ved å fortynne 1 mM stamløsning 50 ganger i HH-buffer (tilsett 490 μL HH-buffer til 1 alikvot av 10 μl TMRM stamløsning).
- Forbered en lastInnløsning med 2 μM CM-H2 DCFDA og 100 nM TMRM. Til dette formål fortynne 1 mM CM-H 2 DCFDA stamløsning 500x og 20 μM TMRM arbeidsoppløsning 200x i HH-buffer.
- Typisk for 60 brønner lagrer man 7,5 ml påleggsoppløsning ved å tilsette 15 μl CM-H2 DCFDA og 37,5 μL TMRM-oppløsning til 7447,5 μL HH.
- Kast kultursmediet fra cellene ved å dreie platen opp ned i en enkelt væskebevegelse.
- Vask forsiktig cellene to ganger med HH-buffer ved bruk av en flerkanalspipett (100 μl / brønn). Kast HH-bufferen mellom vaskestrinnene ved å dreie platen opp ned i en enkelt væskebevegelse.
- Legg cellene med CM-H 2 DCFDA og TMRM ved å tilsette 100 μL av lasteproduktet til hver brønn, igjen ved bruk av en flerkanalspipett. Inkuber i 25 minutter i mørket ved romtemperatur. Ikke glem godt B01.
- I løpet av disse 25 minene skal du forberede arbeidsløsninger av oksidanten TBHP og sørge for at mikroskopet og tilleggsutstyret er slått på.
- Forbered arbeidsløsning I: Fortynn 7M stamløsning 70x til 100 mM (10 μl lager i 690 μL HH-buffer).
- Forbered arbeidsløsning II: Fortynn WS I 100x til 1 mM (10 μl WS I i 990 μL HH-buffer).
- Forbered arbeidsløsning III: Fortynn WS III 25x til 40 μM (for 60 brønner tilsatt 300 μL WS II i 7200 μL HH buffer).
- Etter 25 minutter vaskes cellene igjen to ganger med 100 μl HH-buffer som beskrevet tidligere.
- Tilsett 100 μL HH-buffer til alle 60 indre brønner.
5. Første Live Imaging Round for å måle basal ROS nivåer og Mitochondrial Morphofunction (± 15 min)
- Pass på at oppkjøpsprogramvaren er i bruk og bildeprotokollen er lastet.
- Plasser platen på mikroskopet, skru på maskinvaren baSed autofokus-system og bruk brønn B01 for å justere autofokusforskyvningen ved hjelp av TMRM-kanalen. Da denne prosedyren induserer en økning i CM-H 2 DCFDA signal intensitet, er denne brønnen ekskludert fra nedstrøms bildeanalyse.
- Kjør bildebehandlingsprotokollen.
6. Second Live Imaging Round etter tilsetning av TBHP for å måle inducerte ROS nivåer (± 20 min)
- Fjern forsiktig 96-brønnplaten fra mikroskopet.
- Tilsett 100 μl TBHP WS III (40 μM) til hver brønn ved hjelp av en flerkanalspipett (Dette resulterer i en 20 μM TBHP-konsentrasjon i brønnene). Denne forbindelsen brukes som en intern positiv kontroll for CM-H 2 DCFDA-fargingen (signalet skal stige), samt et middel for å måle induserte ROS-nivåer.
MERK: H 2 O 2 kan også brukes i stedet for TBHP, men denne forbindelsen er mindre stabil og derfor mindre pålitelig. - Vent minst 3 min for å tillate fullstendig reaksjon av TBHP wMed CM-H 2 DCFDA.
- I løpet av denne tiden, tilsett 100 μL antistoff-arbeidsløsning (1/1000) til brønn A01.
- Monter platen tilbake på mikroskopet og kontroller fokus igjen ved å bruke brønn B01.
- Oppnå de samme stillingene som i den første bildebehandlingen med samme bildebehandling.
- Eksporter de oppkjøpte datasettene i en enkelt mappe som individuelle TIFF-filer ved hjelp av standardisert nomenklatur som inkluderer referanse til platen, pre- eller post-TBHP-behandling, brønn, felt og kanal, skilt med understreker, f.eks . 'P01_Pre_B02_0001_C1' for plate 1, pre-TBHP-behandling, brønn B02, felt 1 og kanal 1. Denne informasjonen vil bli brukt under bildeanalyse (for eksempel å velge de relevante segmenteringsinnstillingene), samt i dataanalyse (for å koble analysedata Med de riktige behandlingene).
- Oppnå flatfeltbilder for begge kanalene på alle fire posisjoner rundt midten av brønn A01 ved hjelp av oppkjøpsprotokollen. Lagre thEm som individuelle tiff-filer i samme mappe som de andre bildene ved hjelp av følgende standardiserte nomenklatur: 'P01_FF_A01_0001_C1' for plate 1, felt 1 og kanal 1. Kontroller at signalene ligger godt innenfor det dynamiske området; Ved metning, bruk en lavere konsentrasjon av antistoff-arbeidsløsning.
- Kast platen eller lagre for videre behandling.
MERK: I stedet for å fjerne platen fra mikroskopet og bruke en flerkanalspipett for å legge til TBHP-løsningen, kan en automatisert pipette installeres på mikroskopfasen og kobles til oppkjøpsprogramvaren for å fungere ved mottak av en trigger. Dette gjør det mulig å legge TBHP til hver brønn umiddelbart etter første oppkjøp, før du går videre til neste brønn. På denne måten, når den første avbildningsrunden er ferdig, kan den andre starte med en gang, og alle brønner vil ha en lik inkubasjonstid med TBHP.
7. Bildebehandling og analyse (± 30 min per96-brønn plate)
MERK: All bildebehandling utføres i FIJI (http://fiji.sc), en pakket versjon av ImageJ freeware. Et dedikert skript ble skrevet for automatisert analyse av intracellulære ROS- og mitokondriske signaler, samt morfologiske parametere (RedoxMetrics.ijm, tilgjengelig på forespørsel). De underliggende algoritmer er beskrevet i Sieprath et al. 1 .
- Pass på at FIJI er installert og operativt.
- Start opp FIJI og installer makrosettet (Plugins -> Macros -> Install ...). Dette vil påkalle et antall nye makrokommandoer, samt et sett med handlingsverktøy for å optimalisere analyseinnstillingene, som vist i figur 3A .
- Åpne oppsettgrensesnittet for å angi analyseinnstillingene ved å klikke på 'S' -knappen ( Figur 3B ).
- Velg bildetype, antall kanaler og brønnen som ble bruktFor å anskaffe flatfieldbilder.
- Angi hvilken kanal som inneholder celler (CM-H 2 DCFDA-kanal) eller mitokondrier (TMRM-kanal) og juster forhåndsbehandlings- og segmenteringsparametrene for hver kanal, avhengig av bildekvaliteten ( figur 3B ). Merk av i boksene Bakgrunn og Kontrast for å utføre bakgrunnsuttrekk eller kontrastbegrenset adaptivt histogramutjevning 16 . Definer en sigma for Gaussisk uskarphet av celler og Laplacian forbedring av mitokondrier. Velg en automatisk tersklingsalgoritme og fyll inn grenseverdiene for utestenging av grenser (i piksler). Hvis en fast terskel er valgt i stedet for en automatisk terskel algoritme, fyll inn den øvre terskelen.
- Test segmenteringsinnstillingene på noen få utvalgte bilder av de oppkjøpte datasettene ved å åpne dem og klikke på 'C' eller 'M' -knappene i menyen for henholdsvis celle- eller mitokondriasegmentering,Og juster innstillingene om nødvendig. Et eksempelresultat er vist i figur 3C .
- Kjør batchanalysen på den eller de aktuelle mappene ved å klikke på "#" -knappen og velge mappen med bildene. Per mappe vil dette produsere en ny "Output" -katalog som inneholder individuelle avkastningssett (zip-filer) og resultatfiler (.txt) per bilde. For begge kanalene inneholder resultatfilen intensitet og morfologiske deskriptorer. CM-H 2 DCFDA-kanalen (cellene) resultatfilen inneholder per beskrivelse gjennomsnittsverdien for de samlede ROIene innenfor ett bilde. For TMRM-kanalen inneholder resultatfilen per beskrivelse verdien for hvert enkelt segmentert mitokondrialt ROI.
- Etter batchanalyse, visuelt verifiser segmenteringsytelsen på en "Verifikasjonsstabel", en hyperstack av alle bilder med deres respektive ROI-overlegg ved å klikke på "V" -knappen. På denne måten kan gjenstander som over-/ Undersegmentering, bilder uten fokus eller støvpartikler / fibre i bilder kan allerede bli oppdaget raskt. Ytterligere kurering kan gjøres ved datakvalitetskontroll (jf. §8).
8. Dataanalyse, kvalitetskontroll (QC) og visualisering
Behandling og analyse av de rå dataene gjøres ved hjelp av R statistisk freeware (http://www.rproject.org - versjon 3.3.2) og RStudio (http://www.rstudio.com/ - versjon 1.0.44). For å raskt oppnå og visualisere resultatene, er et intuitivt, skinnende program 17 (tilgjengelig på forespørsel) oppfattet som integrerer og visualiserer dataene i varmekart og boksplotter, og utfører også statistiske analyser. Generelt består arbeidsflyten av to påfølgende trinn. Først blir data behandlet og inspisert per 96-brønn plate for å oppdage avvikende datapunkter. For det andre blir kuraterte data fra alle plater av et gitt eksperiment kombinert og analysert ved hjelp av ikke-parametrisk multiVariatortester 18 og en hovedkomponentanalyse.
- Pass på at R og RStudio er installert og operativt.
- Start RStudio.
- Åpne RedoxMetrics skinnende program og kjøre appen (velg å kjøre den i en ekstern nettleser).
- På siden "input" velger du katalogen der resultatfiler fra RedoxMetrics.ijm er plassert.
- Pass på at 'Setup.xlsx' (opprettet i trinn 3.15) også finnes i denne katalogen.
- Resultatfilene og oppsettinformasjonen importeres automatisk, omarrangeres og visualiseres.
- Siden 'eksperimentell oppsett' viser oppsettet for eksperimentet. Bruk denne siden til bekreftelse.
- På neste side, "resultater per plate", vises dataene for hver plate separat i en fargekodet flerbrønnplateoppsett, så vel som i boksplater med utikere merket med brønnenavn og bildenummer. Sistnevnte tillater enkel inspeksjon og identForklaring av avvigende datapunkter (ekstremt høye eller lave verdier i forhold til gjennomsnittsverdiene målt for den spesifikke behandlingen - se figur 4 for et eksempel).
Bruk denne informasjonen, og kontroller bildene som svarer til avvikende punktene. Hvis unormaliteter oppdages, må de fjernes fra analysen. De fleste abnormiteter skyldes feil segmentering når (del) av bildet er ute av fokus, eller når svært fluorescerende støvpartikler forstyrrer riktig segmentering. Ekstreme tilfeller kan allerede bli oppdaget raskt ved hjelp av verifikasjonsstabelverktøyet (trinn 7.5), men mer subtile hendelser oppdages ved dette trinnet. Når ingen åpenbar eller teknisk grunn kan bli funnet for avvikende verdien, bør bildet ikke fjernes fra analyse. - Valgfritt: opprett et nytt regneark kalt 'Drop.xlsx' med bare en kolonne kalt 'Drop'. I denne kolonnen, oppgi filnavnene (inkludert ".tif" -utvidelsen) for alle bildeneSom må fjernes fra analysen (identifisert i trinn 7.5 eller trinn 8.6.2). Last opp denne filen ved hjelp av siden "input".
- Resultatet fra hele eksperimentet viser resultatene fra alle platene kombinert. Hvis en droppfil ble lastet opp, brukes denne filen til å fjerne de angitte datapunktene fra analysen.
For hver parameter enkeltvis blir dataene normalisert per plate i henhold til deres respektive kontroller. Data fra alle plater kombineres deretter, etterfulgt av ikke-parametriske multivariate tester fra nparcomp-pakken 18 . Hvis bare to behandlinger sammenlignes, utføres to prøveforsøk for det ikke-parametriske Behrens-Fisher-problemet. For mer enn 2 behandlinger, brukes en ikke-parametrisk kontrastbasert, multiple sammenligningstest. Resultatene visualiseres ved hjelp av boksplotter. - Klientanalysesiden viser resultatene av en hovedkomponentanalyse (PCA - R kjerne 'statistikkpakke'). Data fra 5 parametre (baSal og indusert ROS og mitokondrielt membranpotensial, størrelse og sirkularitet) kombineres for å diskriminere de forskjellige behandlinger basert på en sensitiv redoksprofil. Til dette formål utføres en hovedkomponentanalyse (PCA) (R-kjerne-statistikkpakken). Resultatene visualiseres ved hjelp av en biplot (ggbiplot-pakke - http://github.com/vqv/ggbiplot).
- Bruk siden "Last ned data" for å laste ned databasene med backend som inneholder de behandlede og omarrangerte dataene slik at de kan gjenbrukes for mer avansert datavisualisering eller statistiske analyser.
MERK: Typiske fallgruver og potensielle løsninger er oppført i tabell 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen er blitt benchmarked ved bruk av flere kontrollforsøk, hvor resultatene er beskrevet i Sieprath et al. 1 . Kort fortalt har fluorescensresponsen av CM-H2 DCFDA og TMRM til extrantinducerte endringer i henholdsvis intracellulær ROS og Δψm blitt kvantifisert for å bestemme det dynamiske området. For CM-H2 DCFDA viste NHDF en lineær økning i fluorescenssignalet når det ble behandlet med økende konsentrasjoner av TBHP mellom et område på 10 μM til 160 μM. På samme måte, for TMRM viste NHDF-celler en lineær økning i mitokondriell fluorescens når de ble behandlet med økende konsentrasjoner av oligomycin (som induserer Δψm hyperpolarisering) innenfor et område på 1 til 10 μg / μl. Omvendt resulterte sanntids tillegg av valinomycin, et antibiotikum som induserer Δψm depolarisering, i en gradvis kvantOmgjengelig reduksjon av TMRM-fluorescens .
Analysen har også blitt brukt i en rekke eksperimenter for å avdekke forskjeller i redoksstatus mellom celletyper eller behandlinger 1 , 15 . For å illustrere dette er resultatene vist av et forsøk hvor NHDF ble behandlet med HIV-proteaseinhibitoren Saquinavir (SQV) ( Figur 5 ). Ved å bruke den beskrevne protokollen ble det påvist en signifikant økning for både basale og induserte ROS-nivåer sammenlignet med kontrollceller behandlet med DMSO ( Figur 5B ). SQV-behandling har også betydelig påvirkning av mitokondriell morfofunksjon. Morfologisk kjøpte mitokondrier et svært fragmentert mønster, som også ble bekreftet av en høyere sirkularitet og mindre gjennomsnittsstørrelse av de enkelte mitokondrier. Funksjonelt, Δψ m , målt som gjennomsnittlig TMRM-signal per mitokOndrial piksel ble også betydelig økt ( figur 5A ). Når man kombinerer dataene til de 5 parametrene beskrevet ovenfor, kunne de to betingelsene (kontroll og SQV) klart separeres fra hverandre ved hovedkomponentanalyse. Data fra tre uavhengige biologiske replikater er vist i en 2D-biplot som viser de to første hovedkomponentene, som forklarer 81,4% av den totale variansen ( Figur 5C ). Dette demonstrerer robustheten av analysen og antyder at den kombinerte avlesningen kan tjene som en sensitiv indikator for cellulær helse status.
Figur 1 : Generell oversikt over High-content Imaging Assay for samtidig måling av intracellulære basale og inducerte ROS nivåer og mitokondriell morphofunction. ( A ) SKjemisk representasjon av de viktigste operasjonelle blokkene. ( B ) Illustrert eksempel: celler blir podet i flere like 96 brønnplater. En standard brønnplateoppsett er vist mer detaljert i figur 2A . Etter farging blir det oppnådd 4 bilder per kanal rundt midten av hver brønn, både før og etter TBHP- behandling, som er illustrert av de store montasjene med innsats. Etter bildeanalyse blir intensitetsresultater visualisert ved hjelp av et intuitivt varmekart projisert på brønnplattformen. Dette muliggjør rask gjenkjenning av platteffekter eller avvikende brønner. Etter helbredelse av de komplette eksperimentelle datasettene, utføres en endelig dataanalyse som resulterer i enkel- og multiparameterutgang. (Denne figuren ble endret fra referanse 1 , med tillatelse fra Springer) Vennligst klikk her for å se et større versioN av denne figuren.
Figur 2 : En typisk eksperimentell 96-brønn layout og tilsvarende "Setup" -fil. ( A ) 4 forskjellige forhold fordeles homogent over de indre 60 brønnene på platen. Vel B01 inneholder også celler, men brukes kun til å justere den opprinnelige PFS-forskyvningen like før bildene. De andre ytre brønner fylles kun med dyrkningsmedium for å minimere gradienter (temperatur, fuktighet, etc. ) under cellekultur. Bildeoppkjøpet utføres på en meanderende måte, dvs. først fra venstre til høyre, fra brønn B02 til B11, deretter tilbake, fra høyre til venstre, fra brønn C11 til C02 og så videre. Etter bildeoppkjøpet blir flatfeltbilder anskaffet i brønn A01, som brukes til å korrigere romlig belysnings heterogenitet under bilde og alysis. ( B ) Den tilsvarende oppsettfilen (Setup.xlsx) er et regneark som inneholder informasjon om eksperimentets oppsett. Det spesifiserer plasseringene til hver behandling i multiwellplaten og deres respektive kontroller. Hver rad representerer en brønn. Hver behandling har sitt eget unike behandlingsnummer, som brukes til å spesifisere rekkefølgen av behandlingene på X-aksen til de genererte tomtene under dataanalyse. Kolonnen 'Kontroll' inneholder behandlingen som skal brukes som en kontroll for normalisering av dataene for behandlingen spesifisert i samme rad. I eksempelet er behandling 1 behandlingen som brukes som kontroll for normalisering av data fra alle de andre behandlingene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
9 / 55449fig3.jpg "/>
Figur 3 : RedoxMetrics Macro-set, Layout og Setup Interface. ( A ) Når makro-settet for RedoxMetrics for FIJI er installert, opprettes en rekke nye makrokommandoer, samt et sett med handlingsverktøy for å teste og optimalisere analyseinnstillingene i menylinjen. 'S' påkaller oppsettgrensesnittet. 'F' utfører en flatfeltkorreksjon på et åpent bilde. 'C' og 'M' utfører en testsegmentering for cellulære områder ("Celle", CM-H2DCFDA-kanal) og mitokondrielle regioner ("Mito", TMRM-kanaler) henholdsvis på et enkelt åpnet bilde ved hjelp av analyseinnstillingene valgt i oppsettet Grensesnitt, returnerer et overlegg av de segmenterte regionene av interesse (ROI). '#' Utfører batchanalyse i en mappe med bilder ved hjelp av innstillingene som er angitt i installasjonsgrensesnittet (vanligvis etter bekreftelse på ett eller noen få bilder). 'V' oppretter en verifisering hyperstack usinG utdataene fra batchanalysen. Denne hyperstacken er et sammensatt bilde av alle råbilder som er tilstede i mappen og deres respektive regioner av interesse (tegnet i en annen kanal). 'O' kan klikkes for å vise eller skjule overlegget til segmentet regionen. ( B ) Oppsettgrensesnitt. Her velges alle analyseinnstillinger, inkludert generell informasjon som bildetype (utvidelse), antall kanaler (bølgelengder) og brønnen som ble brukt til flatfieldkorreksjon. Deretter er det innstillinger som er spesifikke for bildet innholdstype (Cell eller Mito). I begge tilfeller er det alternativer (boksene) for å inkludere en bakgrunnskorreksjon ("bakgrunn") og lokal kontrastforbedring ("kontrast"). For celle segmentering, er det mulighet til å definere en Gaussian sløret radius (Sigma) for å redusere støy. For mito segmentering er det mulighet til å definere radius av en Laplacian operatør for selektiv forbedring av mitokondriene. Senere segmentering er pOmformet ved hjelp av en automatisk (eller fast) terskelmetode som kan defineres per innholdstype. Når en fast terskel er valgt, kan den øvre grenseverdi oppgis manuelt. Endelig kan analysen begrenses til et utvalg av objekter som faller innenfor minimum og maksimal størrelse. ( C ) Et eksempel på et segmenteringsresultat som kjøres med kommandoen "C" (øverst) eller "M" (bunn), vises som det råbildet i grå overlaid med regionene av interesse for gul. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Illustrert eksempel på mellomliggende datavisualiseringer. ( A ) Multiwell plate visualisering hvor brønner B02 og D07 visesmistenkelig. ( B ) Boxplot som representerer de samme dataene, med outliers merket med brønnenavn og bilde navn. Sammen med F03_0003, vises bilder fra B02 og D07 som outliers. ( C ) Visuell inspeksjon av disse bildene viser at B02_0000 og D07_0001 bør fjernes fra videre analyse fordi det er segmenteringsfeil (illustrert av den røde 'X'). F03_0003 bør oppbevares fordi det ikke er noen åpenbar segmentering eller teknisk feil. (Hvis ingen teknisk grunn er funnet for avviket, bør dataene ikke fjernes). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : Effekt av Saquinavir (SQV; 20 μM) på primær humanfibrOblasts (kontroll er DMSO). ( A ) Mitokondrielt membranpotensial (ΔΨ m ) og mitokondriamorfologi (sirkularitet og gjennomsnittsstørrelse av individuelle mitokondrier) målt ved TMRM ( B ) Økt basale nivåer av intracellulær ROS som målt ved CM-H 2 DCFDA og respons mot indusert ROS målt Som relativ forsterkning i intensitet etter tilsetning av 20 μM TBHP tillegg. ( C ) 2D scatterplot av de to første hovedkomponentene (PCer) fra en PCA-analyse på de 5 variablene beskrevet ovenfor (basale og induserte ROS-nivåer, gjennomsnittlig mitokondriell størrelse, sirkularitet og ΔΨ m ). De svarte pilene representerer retningene til de opprinnelige 5 variablene med hensyn til hovedkomponentene. (Uavhengige replikater er plottet med en annen farge; Alle data er normalisert med hensyn til DMSO-kontrollen; * = p-verdi <0,05; ** = p-verdi <0,01; *** = p-verdi <0,001; Y -Akser er justert for å vise forskjellene optimalt Denne figuren ble endret fra referanse 1 , med tillatelse fra Springer) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Problem | Potensiell grunn | Mulig løsning |
| For få celler i brønnene under avbildning | For få celler frøet | Sæd flere celler 24 timer før bildebehandling |
| Dårlig cellevekst | Kontroller kulturforholdene (medium, temperaturstabilitet, CO 2 -kontroll) | |
| For voldelige vaske trinn | Unngå å vaske celler unna, pipett forsiktig | |
| For mange celler i brønnene under bildebehandling | OgsåMange celler frøet | Frø mindre celler 24 timer før bildebehandling |
| Svake signaler eller ikke-lineær respons av CM-H 2 DCFDA fluorescens til stimulus | Brukes for lav / høy fargekonsentrasjon | Hvis du bruker andre enn NHDF-celler, må du optimalisere belastningskonsentrasjonen empirisk |
| Fargestoff er ikke tilstrekkelig | Tilsett 0,02% w / v av overflateaktivt middel Pluronic-127 til fyllingsløsningen for å øke opptaket. | |
| CM-H 2 DCFDA-signal øker visuelt under eksponeringstid | For høy fargekonsentrasjon | Reduser fargekonsentrasjon |
| Excitasjonsintensiteten er for høy | Reduser eksitasjonsintensiteten ved å bruke ND-filtre og / eller redusere eksponeringstiden | |
| CM-H 2 DCFDA intensiteten minker under oppkjøpet av brønnplaten | CM-H 2 DCFDA lekker ut avcellen. | Bruk 2 mM probenicid (anionpumpeinhibitor). Legg til lasteløsningen, samt bildebehandlingsbufferen for å redusere lekkasje |
| Det er ingen økning i CM-H 2 DCFDA signal intensitet etter tilsetning av TBHP | TBHP er ikke aktiv | Bruk fersk TBHP |
| CM-H 2 DCFDA lekker ut av cellen. | Bruk probenicid som beskrevet ovenfor. | |
| (Noen av) oppkjøpte bildene virker utenfor fokus, mens fokuset virker ok når det kontrolleres. | Platen er montert skrå, noe som gjør at fokuset strekker seg utover PFS-forskyvningen | Kontroller monteringen av platen og scenenivået, Sett platen på plass |
| Bunnen av platen inneholder støv eller uregelmessigheter | Rengjør bunnen av platen med et etanolfettet linsepapir | |
| Cellene dør under avbildning | Reduser eksitasjonsintensiteten eller få færre bilder per brønn. | |
| Feil bildebehandlingsbuffersammensetning | Remake bildebehandlingsbuffer | |
| Det er ute av fokus fluorescerende flekker i bildene | Frittstående celler flyter ut av fokus | Vask mer forsiktig under lasteprotokollen |
| En eller flere kolonner har en allover lavere intensitet enn de andre brønnene på platen | Ett eller flere tips fra flerkanalspipetten var ikke fast festet, og derfor ble mindre reporter lagt til disse brønnene | Kontroller grundig om alle tips er fylt perfekt når du bruker en flerkanalspipett. |
| Fokus drift dramatisk under bildeoppkjøpet | Polystyrenbunnen av platen kan reagere med nedsenkningsolje ved bruk av en oljeobjektiv | Bruk et tørt objektiv, eller bruk en multivellplate med et glassSs bunn |
| TMRM-signalintensiteten øker mellom bildebehandling av første og siste brønn | Reporterens ladetid var ikke lenge nok, TMRM er fortsatt likeverdig | Øk reporterens ladetid |
| CM-H 2 DCFDA-signal etter TBHP-behandling øker under oppkjøpet av brønnplaten | Tiden mellom behandling med TBHP og starten på den andre bildesirkelen var ikke lenge nok, og TBHP oksiderer fortsatt CM-H 2 DCFDA. | Øk inkubasjonstiden mellom behandlingen med TBHP og den andre avbildningsrunden. (Start med minst 3 min) |
| Flatfeltbilder er mettede | Antibody arbeidsløsning er å konsentrere seg | Bruk en lavere konsentrasjon av antistoff-arbeidsløsning |
| Oppkjøpsinnstillingene er ikke optimalisert (eksponeringstid til høy, ND-filter til lavt, ...) | Optimaliser oppkjøpsinnstillinger,Signalet må være i dynamisk rekkevidde av sensoren | |
| Flatfeltbilder er mørke | Antibody arbeidsløsning er å fortynne | Bruk en høyere konsentrasjon av antistoff-arbeidsløsning |
| Oppkjøpsinnstillingene er ikke optimalisert (eksponeringstid til høy, ND-filter til lavt, ...) | Optimaliser oppkjøpsinnstillingene, signalet må være i dynamisk rekkevidde av sensoren | |
| Over / Undersegmentering artefakter | Terskel ikke satt riktig | Juster terskelinnstillingen |
| Størrelsesfiltre er ikke justert riktig | Juster kriteriene for min og maks størrelse for bildeanalyse | |
| Cellekonfluens er for høy | Det riktige konfluensnivået er svært viktig for pålitelig bildeanalyse. For andre celletyper enn NHDF må den optimale sjøtettheten bestemmes empirisk | |
| Den skinnende applikasjonen virker ikke | Feil katalog valgt | Velg riktig katalog på inngangssiden. |
| Mangler filer i katalogen | Kontroller at alle nødvendige filer (utgang fra imagej makro og oppsettfil) er til stede i den valgte katalogen | |
| Manglende pakker | Normalt sjekker appen etter og installerer alle nødvendige pakker, men når dette mislykkes, kontrollerer du manuelt for følgende pakker: devtools, ggbiplot, pacman, ggplot2, plyr, nparcomp, data.table, readxl, gplots, ggbiplot, skinnende, glansfiler, pbapply Og shinyjs inkludert alle avhengigheter. |
Tabell 1: Typiske fallgruver og potensielle løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver en mikroskopi med høy innhold for samtidig kvantifisering av intracellulære ROS-nivåer og mitokondriell morfofunksjon i NHDF. Dens ytelse ble demonstrert med en case-studie på SQV-behandlet NHDF. Resultatene støtter tidligere bevis fra litteraturen hvor økte ROS-nivåer eller mitokondriell dysfunksjon har blitt observert etter behandling med HIV-proteasehemmere av type 1, om enn i separate eksperimenter 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Den viktige forskjellen er at den beskrevne analysen kan måle disse parametrene samtidig, i de samme levende celler, sammen med morfologiske data. Den største fordelen med denne tilnærmingen er dens entydige bestemmelse av begge faktorene sammen i rom og tIme, som gjør det mulig å fastslå årsakssammenheng. En hovedkomponentanalyse utføres som muliggjør generering av en sensitiv redoksprofil av spesifikke forstyrrelser. Men mer avanserte data mining teknikker og (overvåket) clustering algoritmer kan også brukes på utvunnet data for å aktivere predictive redox profilering. Dette kan være en verdifull funksjon for diagnostiske eller prognostiske klassifikasjonsverktøy i digital patologi, så vel som i screening for terapeutiske mål, f.eks. Når sterke klassifikasjonsmodeller er opprettet, kan små molekylbiblioteker screenes for å finne terapeutiske kandidater for å motvirke oksidativt stress, analogt med En nylig skjerm for lovende fører i terapiutvikling for humane mitokondriale lidelser 26 .
Analysen ble uttalt for NHDF, men kan tilpasses andre adherente celletyper. Dette krever optimalisering av fargeprotokollen og reporterfargestoffkonsentrasjonene. Mengden av r Eporterfargestoff må minimeres, da overbelastning kan forårsake ulinjære effekter på grunn av quenching eller til og med bli cytotoksisk 27 . Forlengelse av analysen til suspensjonsceller er mindre åpenbar på grunn av vanskeligheter med montering og observasjon av slike celler på en fysiologisk måte. De kan være cytospun på en deksel eller dyrkes i serumfritt medium for å indusere adhesjon, men begge disse prosessene forstyrrer fysiologiske forhold 28 , 29 . Imidlertid kan disse begrensningene overvinnes ved hjelp av mikropatnerte cellekulturbærere som holder individuelle celler (vedhengende eller ikke-vedhengende) fanget i små mikrobrønner mens de opprettholder deres levedyktighet 30 eller ved bruk av en termo-reversibel hydrogel til felle celler under bildebehandling 31 . Disse metodene har allerede blitt brukt for høy-innholds screening av plasmamembranpotensial, eller cellulært oksygen i individuelle suspensjonsceller= "Xref"> 32 , 33 eller avbildning av intracellulære markører i de levende, høymotile parasittene 31 . Tilpasninger vil også måtte gjøres for bildemodaliteten, da morfologisk analyse av mitokondriellnettverket i disse cellene vil kreve raske 3D-oppkjøpsmuligheter, for eksempel spin-disk-konfokal eller Bessel-stråle-lysmikroskopi 34 , 35 , samt analysen Rørledning, for å inkludere Z-dimensjonen mens du beregner morfologiske parametere.
Analysen ble optimalisert for 96-brønnsplater, men det er åpenbart egnet til ytterligere oppskalering, for eksempel til 384 brønnplater. Den største begrensningsfaktoren er platenoppkjøpstid, dvs. tiden det tar å skaffe bilder av alle brønnene. De fluorescerende signalene må forbli stabile i løpet av denne tidsrammen for å kunne sammenligne målingene mellomIndividuelle brønner. Men fordi fargingen er forbigående og prosessen som undersøkes, er dynamisk, utgjør dette en utfordring. Derfor ble fluorescerende signaler målt i et sett med replikerte eksperimenter, og dette viste at både CM-H2 DCFDA og TMRM signaler forblir stabile fra 7 til minst 50 minutter etter farging (variasjonskoeffisient <2%). Dette gir et vindu på ca 40 min. En 96-brønn plate tar vanligvis rundt 10 minutter. Dermed vil en ekstrapolering til 384 brønnplater holde oppkjøpsvarigheten i det stabile tidsluke. Med et gjennomsnitt på 50 celler per bilde (basert på bruk av en 20X objektiv og NHDF celler), vil dette resultere i data for ca. 30.000 celler per time med screening, noe som i stor grad øker til den statistiske effekten av analysen. En annen faktor som påvirker fluorescerende signalstabilitet er temperaturen. For å unngå vakuolisering av CM-H 2 DCFDA (dvs. fargestoff akkumulering i intracellulære vesikler), noe som ville føre til heteroGenøs farging og ikke-lineære effekter, inkuberingen foregår ved romtemperatur i stedet for 37 ° C. Bortsett fra stabilitet er det viktig å merke seg at eksponeringen av levende celler til fluorescens-eksitasjonslyset selv fremkaller ROS-produksjon. Dette innebærer at eksponeringsforholdene (eksponeringstid og eksitasjonslysintensitet) skal holdes på et absolutt minimum. Det betyr også at alle brønner bare skal eksponeres når de faktiske bildene er anskaffet. Dette utelukker bruken av programvareaktiverte autofokuseringsmetoder og garanterer bruken av et maskinvarebasert autofokussystem.
En fordel ved den beskrevne metode er dens generiske karakter. Nesten hvilken som helst kombinasjon av spektral kompatible fluorescerende reportere kan brukes. Dette ble demonstrert ved bruk av Calcein / MitoSOX-kombinasjonen for å måle mitokondriell ROS per levende celle 1 , 15 . Videre er søknadene ikke begrenset til int Egrated ROS / mitokondriell måling. Analysen kan også utvides med en posthoc immunostaining (etter den andre avbildningsrunden). Siden de nøyaktige bildebehandlingsstedene er lagret, kan redoksanalyser korreleres direkte med stedproteomikk i de samme cellene. Dette øker kraftig molekylæravlesningen, som står i sterk kontrast til andre metoder som ofte brukes til å vurdere redoksbiologi eller fluorescensintensiteter generelt. For eksempel er fluorimetri (mikroplate leser) mye brukt på grunn av sin relativt lave kostnad (grunnleggende oppsett tilgjengelig for så lite som € 4000) og grunne læringskurve, men å være en svart boks, er den mer utsatt for forstyrrende faktorer som variasjoner i Celle tetthet eller bakgrunn (auto-) fluorescens, for eksempel av forurensende støvpartikler. Dessuten tillater ikke platelesere utvinning av morfologiske parametere, de kan ikke måle enkeltceller, og de er mindre følsomme og pålitelige for å måle dynamiske eller forbigående signalerLass = "xref"> 36 , 37 . Flowcytometri har kapasitet til å måle enkeltceller og har fordelen av hastighet. Faktisk kan en 384 brønnplate bli vist på så lite som 12 min med høy følsomhet for flere markører 38 . Dette er mye raskere enn det som er mulig med widefield mikroskopi. Men det er fortsatt ingen spatiotemporal informasjon ( dvs. subcellulær lokalisering, morfologiske data og / eller tidsavhengig kinetikk), og det tillater heller ikke å gjenopprette de samme cellene under eller etter en behandling (dvs. i fluxo) . Videre må cellene være i suspensjon, noe som gjør flow-cytometri mindre egnet til å studere fysiologien til adherente celler. Store ulemper ved høymikroskopi sammenlignet med de andre metodene er behovet for stor bildedataoppbevaring, intensiv prosessorkraft og komplekse bildeanalyser. Den presenterte analysen standardiserer bildeoppkjøpsprosessen og strømlinjer analysenS for å minimere denne behandlingstiden, øke brukervennligheten og dermed gjøre analysen mer tilgjengelig.
Som konklusjon, og spesifikk for bruk av CM-H 2 DCFDA og TMRM, er den beskrevne redoksprofileringsmetoden robust, følsom og pålitelig. På grunn av sin multiparametriske og kvantitative natur er den bedre enn andre fluorescensbaserte metoder. På den måten kan det bidra til å belyse forholdet mellom mitokondriell funksjon og intracellulær ROS signalering, noe som er avgjørende for bedre å forstå et bredt spekter av patologier der redox homeostase er forstyrret. Videre gir analysen, på grunn av sin generiske karakter, applikasjoner godt utover det opprinnelige omfanget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne sier at det ikke er konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter. Den tilsvarende forfatteren sikrer også at alle forfattere har blitt bedt om å avsløre noen og alle interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 mL | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1 M 500 mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20X objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
References
- Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
- Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
- Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
- Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
- Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
- Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
- Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
- Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
- Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
- Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
- Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
- Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
- Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
- Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
- Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
- Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
- Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
- Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
- Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
- Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
- Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
- Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
- Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
- Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
- Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
- Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
- Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
- Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
- Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
