In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

Summary

Live-sporing af individuelle WT retinale stamfædre i distinkte genetiske baggrunde giver mulighed for vurdering af bidraget fra celle non-autonome signalering under neurogenese. Her blev en kombination af gen knockdown, kimære generation via embryo transplantation og in vivo time-lapse konfokal billeddannelse anvendes til dette formål.

Abstract

De genetiske og tekniske styrker har gjort zebrafisk hvirveldyr en central model organisme, hvori konsekvenserne af gen-manipulationer kan spores in vivo hele hurtig udviklingsperiode. Flere processer kan studeres herunder celleproliferation, genekspression, cellemigrering og morfogenese. Vigtigt er det, kan frembringelsen af ​​kimærer gennem transplantationer let udføres, så mosaik mærkning og sporing af individuelle celler under indflydelse af værtsmiljøet. For eksempel kan ved at kombinere funktionelle gen manipulationer af værten embryo (f.eks gennem morpholino mikroinjektion) og levende billedbehandling, virkningerne af ydre, celle nonautonomous signaler (leveret af genetisk modificerede miljø) på individuelle transplanterede donorceller vurderes. Her demonstrerer vi, hvordan denne tilgang anvendes til at sammenligne indtræden af ​​fluorescerende transgen udtryk som en proxy for timingen af ​​cellens skæbne determination i forskellige genetiske værtsmiljøer.

I denne artikel giver vi protokollen for mikroinjektion zebrafisk embryoner til at markere donorceller og forårsage gen knockdown i værts embryoner, en beskrivelse af transplantation teknik, der anvendes til at generere kimære embryoner, og protokollen for at forberede og kører i vivo time-lapse konfokal billeddannelse af flere embryoer. Især udfører Multiposition billeddannelse er afgørende, når man sammenligner timingen af ​​begivenheder som indtræden af ​​genekspression. Dette kræver indsamling af data fra flere kontrol og eksperimentelle embryoner behandles samtidigt. En sådan tilgang kan let udvides til studier af ydre påvirkninger i ethvert organ eller væv af valg tilgængelige til at leve billedbehandling, forudsat at transplantationer kan målrettes let i henhold til etablerede embryonale skæbne kort.

Introduction

Evnen til at visualisere vigtige udviklingsprocesser i en in vivo hvirveldyr har bidraget til at gøre zebrafisk en vigtig model til at studere normale og sygdomstilstande (revideret i ^{1, 2).} Især den neurale nethinde er en tilgængelig del af det centrale nervesystem. Nethinden egner sig til nemt at udføre undersøgelser af neurogenese på grund af sin meget organiseret, men alligevel relativt enkle struktur, og dets højt konserverede neuron typer tværs hvirveldyr ^3. Dynamics af cellulære adfærd, såsom spredning, cellecyklus exit, asymmetrisk celledeling, skæbne specifikation, differentiering og neurale kredsløb dannelse kan følges gennem hele processen med retinogenesis, som er afsluttet i den centrale nethinden i zebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Desuden kan de funktionelle krav i forskellige gener i hver af de ovennævnte faser skal samtidig vurderes i zebrafisk nethinden, hvilket giver en fordel frem for andre hvirveldyr modeller, hvor fænotyper som følge af anvendelsen af ​​gen-knockout teknikker kan kun vurderes ved obduktion af fast væv. Navnlig anvendelsen af ​​transgene linjer hvor vi kan visualisere og overvåge ekspressionen af ​​fluorescerende proteiner som reporter transgener i nethinden, giver os mulighed for at opnå tidsmæssige opløsning af genekspression, der ligger til grund for tilblivelsen af ​​en bestemt neuronal celletype. På grund af den hurtige udvikling af zebrafisk, kan disse begivenheder visualiseres under hele udviklingsperiode, hvorved der tilvejebringes dybere indsigt i den tidsmæssige betydning af genekspression i forhold til neuronal erhvervelse celleidentitet og celle adfærd.

Endelig kan disse tilgange kombineres effektivt i zebrafisk med frembringelsen af ​​kimære via transplantationer, hvilket resulterer i indsigter i to centrale aspekter af genfunktion. For det første undersøger celler transplanteret fra en donor embryo, hvor et bestemt gen blev slået ned, mens de udvikler i en umærket vildtype miljø, giver os mulighed for at indhente relevante oplysninger om gen-funktion i en celle-uafhængig måde. Dette fører til vigtige indsigter om funktionen af nethinden skæbne afgørende faktorer inden for stamceller de normalt udtrykkes i. Dette eksemplificeres ved undersøgelsen af udviklingsmæssige skæbne resultatet af stamfædre, der ikke længere kan generere funktionelt protein fra disse gener ^{4, 6, 8, 9.} Ved hjælp denne tilgang, har vi vist, at mange skæbne afgørende faktorer (f.eks Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handle celle-autonomously at køre specifikke retinale neuronale skæbner; manglen på genekspression fører primært til en skæbne switch, således at cellerne med gen knockdown forbliver levedygtige ved at vedtage en alternativ celleskæbnen ^{4, 6, 7, 10.} For det andet kan sådanne kimære eksperimenter bruges til at vurdere, hvordan vildtype stamfædre opfører sig, når de udvikler inden for forskellige genetiske miljøer. For eksempel ved at sammenligne udviklingen af WT-celler, der normalt udtrykker et gen af interesse (og reporter transgen) i et WT versus manipuleret vært miljø (f.eks gen knockout / knockdown), de resulterende virkninger på genekspression og celleskæbne kan vurderes . Manglen på visse neuron typer i værtsmiljøet, for eksempel har vist sig at påvirke vildtype progenitor adfærd i en celle non-autonomt at forspænde dem til at differentiere til det underrepræsenterede or mangler neuron typer ^{4, 7, 11, 12.} I betragtning af at retinale neuroner er født i en bevaret histogenic ordre ved tidsstyret sekventiel ekspression af specifikke neuronale skæbne determinant gener (skæbne genekspression) (revideret i ^13), brugte vi disse metoder til at vise, hvordan timingen af skæbnen genekspression i vildtype stamfædre påvirkes, når disse stamfædre udvikle sig i retinale vært miljøer med inducerede afvigende cellulære kompositioner. Her vil vi skitsere disse tilgange som bevis for, hvordan kombinationen af relativt standard og udbredte teknikker muliggør undersøgelse af timingen af skæbnen genekspression i udviklingen retinale stamfædre ^{8, 9.}

Denne protokol beskriver en eksperimenterende tilgang, der kombinerer time-lapse imaging med lethed af prdanner transplantation i ex vivo udvikle zebrafisk embryo at følge individuelle mosaically mærkede celler i hele perioden af udviklingsmæssige retinogenesis. Ved at udføre funktionelle gen manipulationer enten i værten embryo, donor embryo, begge eller ingen af ​​delene, kan man vurdere celle autonomi genfunktion. Denne fremgangsmåde kan tilpasses bredt til lignende forskningsspørgsmål i et andet system, for hvilken de enkelte komponenter, der er skitseret her, er egnede.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med bestemmelserne i den australske National Health og Medical Research Council regelsæt for pasning og anvendelse af dyr, og blev godkendt af de institutionelle etiske råd. 1. Udarbejdelse af Zebrafisk Voksen fisk parring Opsæt voksne fisk som par (eller to par) i passende størrelse ynglende tanke aftenen før anvendelse. For at holde den kvindelige adskilt fra mandlige, bruge en deler, således at fisk at se,…

Representative Results

Dette arbejde præsenterer en forsøgsprotokol at vurdere ændringer i genekspression timing, når vildtype retinale stamfædre udvikle sig inden en morphant vært foster. De eksperimentelle vært embryoner er Ptf1a morphants, som mangler de mellemliggende født horisontale og amacrine interneuroner i nethinden 7, 26. Disse er blevet sammenlignet med kontrol værten embryoner, som blev injiceret med en standard kontrol morpholino…

Discussion

Forståelse hvilket omfang naboceller påvirke timing af ekspressionen af ​​afgørende celleskæbne afgørende faktorer er afgørende, når der sigtes til effektivt instruere embryonale eller inducerede multipotente stamceller til at differentiere til en specifik post-mitotisk celletype eller endda mønstrede væv. Desuden undersøger disse molekylære begivenheder i udviklingslandene celler i det levende dyr derudover giver relevant dynamik (tidslige og rumlige) oplysninger om de særlige cellulære sammenhænge i …

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6