En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Summary

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

Abstract

Los puntos fuertes genéticos y técnicos han hecho los vertebrados pez cebra un organismo modelo clave en el que las consecuencias de las manipulaciones genéticas pueden ser rastreados en vivo durante todo el periodo de desarrollo rápido. Múltiples procesos pueden ser estudiados incluyendo la proliferación celular, la expresión génica, la migración celular y morfogénesis. Es importante destacar que la generación de quimeras a través de trasplantes puede realizarse fácilmente, lo que permite el etiquetado de mosaico y el seguimiento de las células individuales bajo la influencia del medio ambiente host. Por ejemplo, mediante la combinación de manipulaciones de genes funcionales del embrión de acogida (por ejemplo, mediante microinyección morfolino) y las imágenes en vivo, los efectos de la extrínseca, señales celulares no autónomas (proporcionados por el entorno modificado genéticamente) en las células del donante trasplantadas individuales pueden evaluarse. Aquí se demuestra cómo se utiliza este método para comparar la aparición de la expresión transgénica fluorescente como un proxy para la sincronización de deter destino de la célulaación en diferentes entornos host genética.

En este artículo, proporcionamos el protocolo para la microinyección de embriones de pez cebra para marcar las células del donante y para provocar la precipitación de genes en embriones de acogida, una descripción de la técnica de trasplante usado para generar embriones quiméricos, y el protocolo para la preparación y administración in vivo confocal de lapso de tiempo obtención de imágenes de múltiples embriones. En particular, la realización de imágenes de varias posiciones es crucial cuando la comparación de tiempo de los eventos tales como la aparición de la expresión génica. Esto requiere la recopilación de datos de control múltiple y embriones experimentales procesados ​​simultáneamente. Este enfoque se puede ampliar fácilmente para los estudios de las influencias extrínsecas en cualquier órgano o tejido de elección accesible a imágenes en directo, siempre que los trasplantes pueden ser dirigidos fácilmente de acuerdo con los mapas de destino embrionarias establecidas.

Introduction

La capacidad de visualizar los procesos de desarrollo importantes en un vertebrado in vivo ha contribuido a que el pez cebra un modelo clave para el estudio de las condiciones normales y de enfermedad (revisado en ^{1, 2).} En particular, la retina neural es una parte accesible del sistema nervioso central. La retina se presta a realizar fácilmente estudios de la neurogénesis debido a su muy organizado, sin embargo, la estructura relativamente simple, y sus tipos de neuronas altamente conservadas a través de especies de vertebrados ^3. Dinámica de comportamientos celulares tales como la proliferación, la salida del ciclo celular, la división celular asimétrica, la especificación del destino, la diferenciación y la formación de los circuitos neuronales se pueden seguir a lo largo de todo el proceso de retinogenesis, que se completa en la retina central del pez cebra por 3 d después de la fecundación ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Por otra parte, los requisitos funcionales de genes diferentes en cada una de las etapas mencionadas anteriormente se pueden evaluar de forma concomitante en la retina del pez cebra, proporcionando una ventaja sobre otros modelos de vertebrados en el que los fenotipos resultantes de la aplicación de técnicas gen knockout sólo puede ser evaluado en el examen post-mortem de fijo tejidos. En particular, el uso de líneas transgénicas en las que podemos visualizar y controlar la expresión de proteínas fluorescentes como transgenes reportero en la retina, nos permite obtener la resolución temporal de la expresión génica que subyace en la génesis de un tipo celular neuronal particular. Debido al rápido desarrollo de pez cebra, estos eventos pueden ser visualizados durante todo el periodo de desarrollo, proporcionando así una visión más profunda en la importancia temporal de la expresión génica en relación con la adquisición de identidad de la célula neuronal y el comportamiento celular.

Por último, estos enfoques pueden ser combinados de manera eficiente en el pez cebra con la generación de la quimera a través de trasplantes, lo que resulta en puntos de vista en dos aspectos clave de la función de genes. En primer lugar, las células trasplantadas de un embrión donante, en el que un gen particular fue derribado antes de que se desarrollan en un entorno de tipo salvaje no marcada en el examen, nos permite obtener información relevante acerca de la función de genes en una celda de manera autónoma. Esto conduce a importantes conocimientos sobre la función de los factores de destino determinantes de la retina dentro de las células progenitoras que normalmente se expresan en. Esto se ejemplifica por el examen de los resultados destino de desarrollo de progenitores que ya no pueden generar proteína funcional a partir de estos genes ^{4, 6, 8, 9.} Utilizando este enfoque, hemos demostrado que los factores determinantes muchos de destino (por ejemplo, Vsx1, atoh7, Ptf1a, Barhl2) actúan célula-autonomously para conducir destinos neuronales retinianas específicas; la falta de expresión de genes conduce principalmente a un conmutador de destino, de modo que las células con el gen desmontables permanecen viables mediante la adopción de un destino alternativo celular ^{4, 6, 7, 10.} En segundo lugar, tales experimentos quiméricos se pueden utilizar para evaluar la forma de tipo salvaje progenitores comportan cuando se desarrollan dentro de diferentes entornos genéticos. Por ejemplo, comparando el desarrollo de las células WT que normalmente expresan un gen de interés (y transgén reportero) en un WT frente a entorno de acogida manipulada (por ejemplo, eliminación de genes / caída), los efectos resultantes sobre la expresión génica y destino de las células se pueden evaluar . La falta de ciertos tipos de neuronas en el entorno de acogida, por ejemplo, se ha demostrado que influyen en el comportamiento progenitor de tipo salvaje de una manera no autónoma de células, al sesgo de ellos hacia la diferenciación en el o subrepresentadosr falta tipos de neuronas ^{4, 7, 11, 12.} Dado que las neuronas de la retina nacen en un orden histogenic conservada por la expresión secuencial temporizada de genes específicos destino determinantes neuronales (la expresión génica destino) (revisado en ^13), hemos utilizado estos métodos para demostrar cómo el momento de la expresión génica destino en progenitores de tipo salvaje se ve afectada cuando estos progenitores se desarrollan en entornos host de la retina con composiciones celulares aberrantes inducidos. A continuación, describimos estos enfoques como evidencia de cómo la combinación de técnicas relativamente estándar y ampliamente utilizado permite que el examen de las fechas de la expresión génica destino en el desarrollo de la retina progenitores ^{8, 9.}

Este protocolo describe un método experimental que combina imágenes de lapso de tiempo con la facilidad de performando el trasplante en el ex vivo el desarrollo de embrión de pez cebra a seguir mosaically individuo células marcadas a lo largo de todo el período de retinogenesis desarrollo. Mediante la realización de las manipulaciones de genes funcionales ya sea en el embrión de acogida, embrión donante, ambos o ninguno, uno puede evaluar la autonomía de células de la función génica. Este enfoque se puede adaptar ampliamente a las preguntas de investigación similares en cualquier otro sistema para el cual los componentes individuales descritos aquí son adecuados.

Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las disposiciones del Código de Australia Consejo de Investigación Médica Nacional de Salud y de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por los comités de ética institucionales. 1. Preparación de Pez cebra apareamiento de los peces adultos Creó los peces adultos en forma de pares (o dos pares) en los tanques de cría de tamaño adecuado la noche antes de su uso. Para man…

Representative Results

Este trabajo presenta un protocolo experimental para evaluar los cambios en el gen de expresión cuando la sincronización de tipo salvaje retina progenitores desarrollan dentro de un embrión de acogida morphant. Los embriones de acogida experimentales son morphants Ptf1a, que carecen de las interneuronas horizontales y amacrinas nacidos intermedios de la retina 7, 26. Éstos se han comparado con el control de los embriones de a…

Discussion

La comprensión de la medida en que las células vecinas influencia de sincronización de la expresión de factores que determinan el destino celular crucial es esencial cuando el objetivo de instruir eficazmente células madre multipotentes embrionarias o inducidas a diferenciarse en un tipo de célula post-mitótico específico o incluso tejido patrón. Además, el examen de estos eventos moleculares en las células en desarrollo del animal vivo, además, proporciona dinámica relevante información (temporal y espaci…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6