Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Summary

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Abstract

I punti di forza genetici e tecnici hanno fatto la vertebrati zebrafish organismo modello chiave in cui le conseguenze di manipolazioni genetiche possono essere rintracciate in vivo per tutto il periodo di sviluppo rapido. Più processi possono essere studiati tra cui la proliferazione cellulare, l'espressione genica, la migrazione delle cellule e la morfogenesi. È importante sottolineare che la generazione di chimere attraverso trapianti possa essere effettuata facilmente, permettendo etichettatura mosaico e monitoraggio delle singole celle sotto l'influenza dell'ambiente host. Ad esempio, mediante la combinazione di manipolazioni funzionali di geni dell'embrione host (ad esempio, attraverso morfolino microiniezione) e l'imaging dal vivo, gli effetti di estrinseco, segnali non autonomi cellulari (forniti dall'ambiente geneticamente modificati) su singole cellule del donatore trapiantate possono essere valutate. Qui mostriamo come questo approccio viene utilizzato per confrontare l'insorgenza di espressione del transgene fluorescente come proxy per i tempi del destino delle cellule determinzione in diversi ambienti host genetica.

In questo articolo, forniamo il protocollo per microinjecting embrioni di zebrafish per marcare cellule del donatore e di causare silenziamento genico in embrioni di accoglienza, una descrizione della tecnica di trapianto usato per generare embrioni chimerici, e il protocollo per la preparazione e l'esecuzione in vivo confocale time-lapse imaging più embrioni. In particolare, l'esecuzione di imaging multiposizione è cruciale quando si confrontano tempistica di eventi come l'insorgenza di espressione genica. Ciò richiede la raccolta di dati dal controllo multiplo e embrioni sperimentali elaborati contemporaneamente. Tale approccio può essere facilmente esteso per gli studi di influenze estrinseche in qualsiasi organo o tessuto di scelta accessibili a vivere l'imaging, a condizione che i trapianti possono essere mirati facilmente in base alle mappe destino embrionali stabiliti.

Introduction

La possibilità di visualizzare importanti processi di sviluppo in un vertebrato in vivo ha contribuito a rendere il pesce zebra un modello chiave per lo studio condizioni normali e di malattia (recensione in ^{1, 2).} In particolare, la retina neurale è una parte accessibile del sistema nervoso centrale. La retina si presta per effettuare facilmente studi di neurogenesi per la sua altamente organizzata, ma struttura relativamente semplice, ed i suoi tipi di neuroni altamente conservati tra le specie di vertebrati ^3. Dinamica dei comportamenti cellulari come la proliferazione, l'uscita del ciclo cellulare, la divisione cellulare asimmetrica, specifica il destino, la differenziazione, e la formazione di circuiti neurali possono essere seguiti durante tutto il processo di retinogenesi, che si completa nella retina centrale del pesce zebra da 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Inoltre, i requisiti funzionali dei diversi geni in ciascuna delle fasi di cui sopra possono essere contemporaneamente valutati nella retina zebrafish, fornendo un vantaggio rispetto ad altri modelli di vertebrati in cui fenotipi derivanti dall'applicazione di tecniche di gene knockout può essere valutata solo dopo l'esame post-mortem di fisso tessuti. In particolare, l'uso di linee transgeniche in cui possiamo visualizzare e monitorare l'espressione di proteine ​​fluorescenti come transgeni giornalista nella retina, ci permette di ottenere risoluzione temporale di espressione genica che sottende la genesi di un particolare tipo di cellule neuronali. A causa del rapido sviluppo di zebrafish, questi eventi possono essere visualizzati durante l'intero periodo di sviluppo, fornendo in tal modo una più profonda comprensione sull'importanza temporale di espressione genica in relazione all'acquisizione identità delle cellule neuronali e il comportamento delle cellule.

Infine, questi approcci possono essere combinati in modo efficiente nel pesce zebra con la generazione di chimere via trapianti, con conseguente intuizioni in due aspetti fondamentali della funzione del gene. In primo luogo, esaminando le cellule trapiantate da un embrione donatore, in cui un particolare gene è stato abbattuto mentre si sviluppano in un ambiente senza etichetta wild type, ci permette di ottenere le informazioni pertinenti circa la funzione del gene in modo cellula-autonomo. Questo porta a importanti intuizioni circa la funzione di fattori destino determinanti della retina all'interno delle cellule progenitrici sono normalmente espressi in. Questo è esemplificato dal l'esame dei risultati destino di sviluppo dei progenitori che non può più generare proteina funzionale di questi geni ^{4, 6, 8, 9.} Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che i fattori determinanti molti Fate (ad esempio, Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) agiscono cellule-autonomously guidare specifici sorti neuronali della retina; la mancanza di espressione genica comporta principalmente un interruttore destino, tale che le cellule con silenziamento genico rimangono vitali adottando un destino alternativo cella ^{4, 6, 7, 10.} In secondo luogo, tali esperimenti chimerici possono essere utilizzati per valutare come selvaggio di tipo progenitori si comportano quando si sviluppano all'interno di diversi ambienti genetici. Ad esempio, confrontando lo sviluppo di cellule WT che normalmente esprimono un gene di interesse (e giornalista transgene) in un WT rispetto ambiente host manipolato (ad esempio, gene knockout / knockdown), gli effetti derivanti sull'espressione genica e destino cellulare possono essere valutati . La mancanza di alcuni tipi di neuroni in ambiente host, ad esempio, è stato dimostrato di influenzare wild type comportamento progenitore in maniera cellule non autonomo, per sollecitare loro verso differenziazione nel o sottorappresentatir mancante tipi di neuroni ^{4, 7, 11, 12.} Dato che i neuroni della retina sono nati in un ordine histogenic conservata dalla fasatura sequenziale espressione di specifici geni destino determinanti neuronali (destino espressione genica) (rivisto in ^13), abbiamo utilizzato questi metodi per dimostrare come la tempistica di espressione genica destino in progenitori di tipo selvatico è influenzato quando tali progenitori si sviluppano in ambienti host della retina con composizioni cellulari aberranti indotte. Qui, descriviamo questi approcci come prova di come la combinazione di tecniche relativamente standard e ampiamente utilizzati consente l'esame della tempistica di espressione genica destino nello sviluppo di progenitori retinici ^{8, 9.}

Questo protocollo descrive un approccio sperimentale che combina l'imaging time-lapse con la facilità di ogniformando il trapianto nella ex vivo in via di sviluppo dell'embrione zebrafish per seguire mosaically individuale cellule marcate durante l'intero periodo di retinogenesi sviluppo. Eseguendo manipolazioni genetiche funzionali sia nell'embrione di accoglienza, embrione donatore, entrambi o nessuno, si può valutare l'autonomia delle cellule della funzione del gene. Questo approccio può essere adattato ampiamente domande di ricerca simili a qualsiasi altro sistema per cui i singoli componenti descritti qui sono adatti.

Protocol

Tutte le procedure sono state effettuate secondo le disposizioni del codice australiana National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono stati approvati dai comitati etici istituzionali. 1. Preparazione di Zebrafish Adulti abbinamento pesce Impostare pesci adulti come coppie (o due coppie) in vasche di allevamento di dimensioni in modo appropriato la sera prima dell'uso. Per mantenere la femmina separata dal m…

Representative Results

Questo lavoro presenta un protocollo sperimentale per valutare i cambiamenti nel gene tempistica espressione quando wild type progenitori della retina si sviluppano all'interno di un embrione di accoglienza morphant. Gli embrioni di accoglienza sperimentali sono morphants PTF1A, cui mancano le interneuroni orizzontali e amacrine nati intermedi della retina 7, 26. Questi sono stati confrontati per controllare embrioni host, ch…

Discussion

Capire la misura in cui le cellule vicine influenzano tempistica di espressione di fattori determinanti cruciali destino delle cellule è fondamentale quando si mira ad istruire efficacemente le cellule staminali multipotenti embrionali o indotte a differenziarsi in un tipo di cellula post-mitotico specifiche o addirittura tessuti a motivi geometrici. Inoltre, l'esame di questi eventi molecolari nelle cellule in via di sviluppo animale vivente fornisce inoltre dinamiche relative informazioni (temporale e spaziale) s…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6