In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Summary

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

Abstract

De genetische en technische troeven hebben de zebravis gewervelde een belangrijk modelorganisme waarin de gevolgen van gen-manipulaties kunnen worden getraceerd in vivo gedurende de snelle ontwikkelingsperiode gemaakt. Meerdere processen kunnen worden onderzocht waaronder celproliferatie, genexpressie, celmigratie en morfogenese. Belangrijk, kan het genereren van chimeren door middel transplantaties gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor mozaïek etikettering en volgen van individuele cellen onder invloed van de nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, door het combineren functioneel gen manipulaties van de ontvangende embryo (bijvoorbeeld door micro-injectie morfolino) en levende beeldvorming, de effecten van extrinsieke signalen nonautonomous cellen (aangeleverd door de genetisch gemodificeerde milieu) individuele getransplanteerde donor cellen kan worden geëvalueerd. Hier laten we zien hoe deze aanpak wordt gebruikt om het begin van fluorescerende transgenexpressie vergelijken als proxy voor de timing die het lot determinatie in verschillende genetische host-omgevingen.

In dit artikel geven we het protocol voor microinjecting zebravis embryo's donorcellen te markeren en te-gen knock-down in gastheer embryo's, een beschrijving van de transplantatie techniek die wordt gebruikt om chimere embryo's te genereren, en het protocol voor de voorbereiding en uitvoering in vivo time-lapse confocale veroorzaken beeldvorming van meerdere embryo. Vooral uitvoeren op meerdere beeldvorming is cruciaal bij het vergelijken van de timing van gebeurtenissen zoals het ontstaan ​​van genexpressie. Dit vereist het verzamelen van gegevens uit meerdere controle en experimentele embryo's tegelijk verwerkt. Een dergelijke benadering kan eenvoudig worden uitgebreid voor onderzoek extrinsieke invloeden in een orgaan of weefsel van keuze toegankelijke imaging leven, mits transplantaties gemakkelijk kunnen worden gericht volgens de gevestigde embryonale lot kaarten.

Introduction

De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in ^{1, 2).} Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species ^3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetrische celdeling, het lot specificatie, differentiatie en neurale vorming circuits kan het gehele proces van retinogenesis, die de centrale retina van de zebravis wordt aangevuld met 3 d postfertilization volgen ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Bovendien kan de functionele eisen van verschillende genen in elk van de bovengenoemde stappen gelijktijdig worden beoordeeld in de zebravis netvlies, waardoor een voordeel boven andere vertebraat modellen waarin fenotypen uit de toepassing van gen knockout technieken kunnen alleen worden beoordeeld na autopsie van gefixeerde weefsels. Met name het gebruik van transgene lijnen waarin we visualiseren en controleren de expressie van fluorescerende eiwitten reporter transgenen in de retina, kunnen we tijdresolutie van genexpressie die het ontstaan ​​van een bepaald celtype neuronale grondslag verkrijgen. Door de snelle ontwikkeling van de zebravis, kunnen deze gebeurtenissen worden gevisualiseerd gedurende de gehele ontwikkelingsperiode, waardoor diepere inzichten in de temporele belang van genexpressie ten opzichte van neuronale cellen identiteitsverwerving en celgedrag.

Tenslotte kunnen deze benaderingen efficiënt gecombineerd in de zebravis met de productie van chimeer via transplantaties, waardoor inzicht in twee belangrijke aspecten van genfunctie. Ten eerste behandeling getransplanteerd van een donor embryo, waarin een bepaald gen werd neergeslagen terwijl zij ontwikkelen een ongelabeld wildtype milieu, kunnen we relevante informaties genfunctie in een cel-autonome wijze te verkrijgen. Dit leidt tot belangrijke inzichten over de functie van retinale lot bepalende factoren binnen de progenitorcellen zij worden doorgaans uitgedrukt in. Een voorbeeld hiervan is het onderzoek van de ontwikkeling lot resultaat van voorlopers die niet meer functioneel eiwit te genereren van deze genen ^{4, 6, 8, 9.} Met behulp van deze aanpak, hebben we laten zien dat veel lot bepalende factoren (bijvoorbeeld Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handelen cel-autonomously specifieke retinale neuronale lot te rijden; het ontbreken van genexpressie voornamelijk leidt tot een lot schakelaar, zodat de cellen met gen knockdown levensvatbare door eerst een alternatieve lot van de cel ^{4, 6, 7, 10} blijven. In de tweede plaats kan een dergelijke chimerische experimenten worden gebruikt om te beoordelen hoe wild type voorouders gedragen wanneer ze binnen de verschillende genetische omgevingen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld door vergelijking van de ontwikkeling van WT cellen die gewoonlijk een gen van belang (en reporter transgen) in WT versus gemanipuleerde nieuwe omgeving (bijvoorbeeld gen knockout / knockdown) tot expressie, de daaruit voortvloeiende effecten op genexpressie en lot van de cel kan worden beoordeeld . Het ontbreken van bepaalde neuronen in de nieuwe omgeving, bijvoorbeeld, is aangetoond dat wild type voorlopercellen te beïnvloeden in een cel non-autonome wijze, om vertekening hen naar differentiatie in de ondervertegenwoordigd or ontbrekende neuron typen ^{4, 7, 11, 12.} Gezien het feit dat het netvlies neuronen worden geboren in een geconserveerd histogenic bestelling door de opeenvolgend getimede expressie van specifieke neuronale lot determinant genen (lot genexpressie) (beoordeeld in ^13), gebruikten we deze methoden om aan te tonen hoe de timing van het lot genexpressie in wild type voorlopers wordt beïnvloed wanneer dergelijke voorlopers ontwikkelen retinale hostomgevingen met geïnduceerde afwijkende cellulaire composities. Hier schetsen we deze benaderingen als bewijs voor hoe de combinatie van relatief standaard en meest gebruikte technieken maakt het onderzoek naar de timing van het lot genexpressie in de ontwikkeling van het netvlies voorouders ^{8, 9.}

Dit protocol beschrijft een experimentele benadering combineren time-lapse imaging met het gemak van perhet vormen van transplantatie in de ex vivo ontwikkeling van de zebravis embryo individuele mosaically volgen gelabelde cellen gedurende de gehele periode van ontwikkelings retinogenesis. Door het uitvoeren van functionele gen manipulaties, hetzij in de gastheer embryo, donor embryo, beide of geen van beide, kan men de cel autonomie van gen-functie te beoordelen. Deze benadering kan wijd aangepast soortgelijke vraagstellingen in andere systemen waarvoor de afzonderlijke componenten hier beschreven geschikt.

Protocol

Alle procedures werden overeenkomstig de bepalingen van de Australische National Health en Medical Research Council gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren uitgevoerd en werden goedgekeurd door de institutionele ethische comités. 1. Voorbereiding van de zebravis Volwassen vissen pairing Opgezet volwassen vissen als paren (of twee paren) in de juiste maat kweekbakken de avond vóór gebruik. Het vrouwelijke gescheiden van de mannelijke houden ge…

Representative Results

Dit werk geeft een experimentele protocol om veranderingen in genexpressie timing beoordelen wanneer wild type netvlies voorouders ontwikkelen binnen een morphant gastheer embryo. De experimentele gastheer embryo's Ptf1a morphants, die de tussenliggende geboren horizontale en amacrine interneuronen van het netvlies 7, 26 missen. Deze werden vergeleken gastheer embryo's die waren geïnjecteerd met een standaard controle mo…

Discussion

Inzicht in de mate waarin naburige cellen beïnvloeden timing van de expressie van cruciaal lot van de cel bepalend is essentieel als doel efficiënt instrueren embryonale of geïnduceerde multipotente stamcellen te differentiëren in een bepaalde post-mitotische celtype of weefsel patroon. Het bestuderen deze moleculaire gebeurtenissen in de ontwikkeling van cellen van de levende dieren verschaft bovendien relevante dynamische (temporele en ruimtelijke) gegevens over de specifieke cellulaire contexten gerelateerd aan d…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6