Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için
Summary
farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.
Abstract
Genetik ve teknik güçlü Zebra balığı omurgalı gen manipülasyon sonuçları hızlı gelişim dönemi boyunca in vivo izlenebilmektedir hangi önemli bir model organizmadır yaptık. Çoklu işlemler hücre çoğalması, gen ekspresyonu, hücre göçü ve morfojenezinin içeren incelenebilir. Önemli olarak, transplantasyon ile kimeralar üretimi kolayca mevcut ortamının etkisi altında mozaik etiketleme ve tek tek hücrelerin izleme sağlayan gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tek nakledilen verici hücreler üzerinde (morfolino mikroenjeksiyon yoluyla örneğin) ana embriyo fonksiyonel gen manipülasyonlar ve canlı görüntüleme, ekstrinsik etkileri (genetik olarak modifiye edilmiş bir ortamda sağlanan) hücre otonom olmayan sinyallerin birleştirilmesi ile değerlendirilebilir. İşte biz bu yaklaşım hücre kaderinin tanımlayabiliriz zamanlaması için bir vekil olarak floresan transgen ifadesi başlangıcını karşılaştırmak için kullanılır nasıl göstermekfarklı genetik konak ortamlarda tirme.
Bu yazıda, donör hücreleri işaretlemek için ve gen konak embriyolarda demonte, kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılan nakli tekniğinin bir açıklama ve hazırlanması ve in vivo time-lapse konfokal çalışan için protokol neden Zebra balığı embriyolar microinjecting için protokol sağlar birden çok embriyo görüntüleme. Bu tür bir gen ifadesinin başlangıcı gibi olaylar zamanlamasını karşılaştırırken Özellikle, birden çok noktaya görüntüleme gerçekleştirmek son derece önemlidir. Bu çoklu kontrol ve eş zamanlı olarak işlenen deneysel embriyolardan veri toplama gerektirir. Böyle bir yaklaşım, kolayca herhangi bir organ ya da görüntüleme yaşamak için erişilebilir seçim dokuda dış etkilerden çalışmaları için uzatılabilir, transplantasyonlar kurulan embriyonik kader haritalarına göre kolayca hedef olabilir şartıyla.
Introduction
In vivo omurgalı önemli gelişim süreçleri görselleştirmek için yeteneği normal ve hastalık koşullarını incelemek için Zebra balığı bir anahtar modeli yapma katkıda bulunmuştur (1 gözden, 2). Özellikle nöral retinanın merkezi sinir sistemi erişilebilir bir parçasıdır. Retina nedeniyle son derece organize, henüz nispeten basit yapısı ve omurgalı türlerin 3 genelindeki yüksek oranda korunmuş nöron tiplerine kolayca nöron çalışmalar yapmak için oldukça rahat. Böyle çoğalması, hücre döngüsü çıkış, asimetrik hücre bölünmesi, kader özellikleri, farklılaşma ve nöral devreler oluşumu gibi hücresel davranışları dinamikleri 3 gün postfertilization tarafından zebrabalıkları merkezi retinada tamamlanır retinogenesis tüm süreç boyunca takip edilebilir ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.
Bundan başka, yukarıda bahsedilen aşamaların her biri farklı genlerin fonksiyonel gereksinimler eş zamanlı olarak, sadece ölüm sonrası inceleme sonucunda tespit edilebilir olup, burada gen knockout tekniklerinin uygulanması sonucu ortaya çıkan fenotipler diğer omurgalı modeller üzerinde bir avantaj sağlayarak, zebra balığı retinada değerlendirilebilir dokularını düzeltildi. Özellikle, görselleştirmek ve retina raportör transgenler olarak floresan proteinleri ifade izleyebilen transgenik hatların kullanımı, ABD, belirli bir nöronal hücre tipinin oluşumunu altında yatan, gen sentezlenmesinin zamansal çözünürlüğü elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Nedeniyle zebrabalıkları hızlı gelişimine, bu olaylar dolayısıyla nöronal hücre kimlik edinme ve hücre davranışı ile ilgili olarak gen ifadesinin zamansal önemi hakkında daha ayrıntılı bilgiler sağlayarak, tüm gelişim döneminde görülebilir.
Son olarak, bu yaklaşımlar, gen fonksiyonu iki temel yönlerine ilişkin olarak elde edilen, transplantasyon ile kimera üretimi ile zebrabalıkları etkin birleştirilebilir. Birincisi, onlar bir etiketsiz vahşi tip ortamında geliştirmek iken belirli bir genin nakavt edildiği bir donör embriyo, nakledilen hücrelerin incelenmesi, hücre-otonom bir şekilde gen fonksiyonu hakkında ilgili bilgi almak için bize izin verir. Bu, normal olarak, artık, bu genler, 4, 6, fonksiyonel proteini oluşturabilir progenitörlerin gelişim kaderi sonucu incelenmesi ile örneklenmiştir. Bu ifade edilmiştir progenitör hücreler içinde retina kaderi belirleyici faktörleri işlevi hakkında önemli noktanın anlaşılmasını yol açar 8, 9. Bu yaklaşımı kullanarak, birçok kader belirleyici faktörler (örneğin, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) hücre hareket ettiklerini göstermiştir-autonomously belirli retina nöronal kaderi sürücü; Gen ifadesinin eksikliği temel olarak demonte gen ile hücreler alternatif bir hücre kaderine 4, 6, 7, 10 benimseyerek canlı kalır, öyle ki bir kader anahtar yol açar. İkincisi, bu tür kimerik deneyler farklı genetik ortamlar içinde geliştiğinde tip ataları nasıl davranacağını vahşi değerlendirmek için de kullanılabilir. Örneğin, genellikle manipüle ana bilgisayar ortamında (örneğin, gen nakavt / demonte) karşısında WT ilgi (ve muhabir transgen) bir gen ifade WT hücrelerinin gelişimini karşılaştırarak, gen ifadesi ve hücre kaderi üzerinde çıkan etkileri değerlendirilebilir . Ev sahibi ortamında bazı nöron tipleri olmaması, örneğin, daha az temsil o ayırma yöntemi önyargılı için onları, hücre otonom-olmayan bir şekilde, yabani tip progenitör davranışını etkilemek için gösterilmiştirNöron türleri 4, 7, 11, 12 eksik r. Retina nöronlar (13 gözden) belirli nöronal kaderi belirleyici gen sırayla zamanlı ifadesi (kader gen ifadesi) tarafından korunmuş histogenez sırayla doğarlar göz önüne alındığında, biz göstermek için bu yöntemleri nasıl kullandığını vahşi tip atalarıdır kader gen ifadesinin zamanlaması Bu tür atalarıdır kaynaklı anormal hücre kompozisyonlar ile retina konak ortamlarda gelişebilir zaman etkilenir. Nispeten standart ve yaygın olarak kullanılan tekniklerin kombinasyonu retina atalarıdır 8, 9 gelişmekte olan kader gen ifadesinin zamanlaması incelenmesini sağlar nasıl Burada delil olarak bu yaklaşımları özetlemektedir.
Bu protokol başına kolaylığı ile time-lapse görüntüleme birleştiren deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadırex vivo gelişmekte olan zebrafish embriyo nakli oluşturan bireysel mosaically gelişimsel retinogenesis tüm dönem boyunca etiketli hücreleri takip etmek. fonksiyonel gen manipülasyonlar yaparak ya ev sahibi embriyo, donör embriyo, her ikisi veya hiçbiri de, bir gen fonksiyonu hücre özerklik değerlendirebilir. Bu yaklaşım Burada özetlenen bileşenleri tek tek uygun olan herhangi bir başka sistemde benzer araştırma sorularına yaygın adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
verimli, belirli bir post-mitotik hücre tipinde, hatta desenli doku içine ayırt etmek için embriyonik veya uyarılmış multipotent kök hücreleri talimat amaçlayan zaman hangi ölçüde komşu hücrelerin hücre zarı kaderi belirleyen faktörlerin ifade zamanlamasını etkilemesi anlamak esastır. Ayrıca, canlı hayvanın gelişmekte olan hücrelerde bu moleküler olayları inceleyen ayrıca ilgili dinamiği in vivo bu olaylar ile ilgili özel hücresel bağlamlarda (zamansal ve mekansal) bilgi sağlar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (PO 1440 / 1-1) LP PRJ bir ARC Decra (DE120101311) tarafından ve bir Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) araştırma bursu ile desteklenmiştir. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Federal Hükümeti fonları tarafından desteklenmektedir. Biz Kei ve ark yayınlanan Burada anlatılan deneyler yaptılar Dr. Jeremy Ng Chi Kei, kabul. 2016 Prof. Higashijima gelen transgenik balık hükümleri için minnettarız ve Profs teşekkür ederiz. H2B-RFP ve H2A-GFP yapıları oluşturmak için pCS2 plazmid Dr. Wilkinson sağlanması için Turner ve Rupp. Biz hayvanların bakımı için FishCore tesis personeli (Monash Üniversitesi) teşekkür ederim.
Materials
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted). |
| borosillicate glass capillary tube w/o filament | SDR Scientfic | 30-0035 | alternatives with similar diameter can be used |
| borosillicate glass capillary tube with filament | SDR Scientfic | 30-0038 | alternatives with similar diameter can be used |
| glass petri dishes (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | any glass alternative of any size |
| Injection tube (2m) | Eppendorf | 524616004 | This connects the needle holder to the syringe during transplantation |
| Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatives with similar shape can be use |
| microneedle holder | Narishige | M-152 | any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used |
| microinjector | Narishige or Eppendorf Femtojet | Pneumatic injector using gas pressure | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | similar alternatives can be used |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904-500ML | |
| needle puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension |
| Parafilm | Interpath | PM996 | any paraffin film |
| Pasteur pipette plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipette glass | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-phenyl thiourea | Sigma | P7629-25G | PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use. |
| Qiaquick gel extraction | Qiagen | 28704 | any alternatives to purify DNA can be used |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | any alternatives to purify RNA can be used |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | any alternatives to transcribe DNA using SP6 |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage – spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
- Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
- Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
- Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
- Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
- Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
- Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
- Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
- Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
- Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
- Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
- De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
- Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
- Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
- La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
- Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
- Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
- Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).
