Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

Summary

अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में अलग-अलग गुम्मट रेटिना progenitors के लाइव ट्रैकिंग न्यूरोजेनेसिस के दौरान सेल गैर स्वायत्त सिगनल के योगदान के आकलन के लिए अनुमति देता है। इधर, भ्रूण प्रत्यारोपण के माध्यम से और इन विवो समय चूक confocal इमेजिंग में जीन पछाड़ना, कल्पना पीढ़ी का एक संयोजन इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया गया था।

Abstract

आनुवंशिक और तकनीकी ताकत zebrafish कशेरुकी एक प्रमुख मॉडल जीव जिसमें जीन जोड़तोड़ के परिणामों के तेजी से विकास की अवधि के दौरान इन विवो में पता लगाया जा सकता बना दिया है। कई प्रक्रियाओं सेल प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, सेल प्रवास और morphogenesis सहित अध्ययन किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, प्रत्यारोपण के माध्यम से काइमेरा की पीढ़ी आसानी से किया जा सकता है, मेजबान वातावरण के प्रभाव में मूसा की लेबलिंग और व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक जीन मेजबान भ्रूण के (जैसे morpholino microinjection के माध्यम से,) व्यक्तिगत प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं पर जोड़तोड़ और लाइव इमेजिंग, बाह्य का प्रभाव, सेल nonautonomous संकेतों (आनुवंशिक रूप से संशोधित वातावरण द्वारा प्रदान की) के संयोजन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यहाँ हम कैसे इस दृष्टिकोण सेल भाग्य determin के समय के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में फ्लोरोसेंट transgene अभिव्यक्ति की शुरुआत तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है का प्रदर्शनविभिन्न आनुवंशिक मेजबान वातावरण में व्यावहारिक।

इस अनुच्छेद में, हम दाता कोशिकाओं को चिह्नित करने और मेजबान भ्रूण में जीन पछाड़ना, chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्रत्यारोपण तकनीक का विवरण, और तैयारी और इन विवो समय चूक confocal में चलाने के लिए प्रोटोकॉल पैदा करने के लिए zebrafish भ्रूण microinjecting के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं कई भ्रूण की इमेजिंग। विशेष रूप से, multiposition इमेजिंग प्रदर्शन महत्वपूर्ण है जब इस तरह के जीन अभिव्यक्ति की शुरुआत के रूप में की घटनाओं के समय की तुलना है। यह कई नियंत्रण और प्रयोगात्मक भ्रूण एक साथ संसाधित से डेटा संग्रह की आवश्यकता है। इस तरह के एक दृष्टिकोण आसानी से किसी भी अंग या पसंद इमेजिंग रहने के लिए सुलभ के ऊतकों में बाह्य प्रभावों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है, बशर्ते कि प्रत्यारोपण आसानी से स्थापित भ्रूण भाग्य नक्शे के अनुसार लक्षित किया जा सकता है।

Introduction

एक विवो कशेरुकी में महत्वपूर्ण विकास की प्रक्रिया कल्पना करने की क्षमता सामान्य और बीमारी की स्थिति के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण zebrafish मॉडल बनाने में योगदान दिया है ⁽¹ में ^{समीक्षा, 2)।} विशेष रूप से, तंत्रिका रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक सुलभ हिस्सा है। रेटिना ही अपने उच्च का आयोजन किया है, फिर भी अपेक्षाकृत सरल संरचना, और हड्डीवाला प्रजातियों ³ भर में इसकी अत्यधिक संरक्षित न्यूरॉन प्रकार के कारण बख्शी आसानी से न्यूरोजेनेसिस की पढ़ाई करने के लिए। इस तरह के प्रसार, सेल चक्र से बाहर निकलें, असममित कोशिका विभाजन, भाग्य विनिर्देश, भेदभाव, और तंत्रिका circuitry गठन के रूप में सेलुलर व्यवहार की गतिशीलता जो zebrafish की केंद्रीय रेटिना में 3 डी postfertilization के साथ पूरा हुआ retinogenesis की पूरी प्रक्रिया, भर पीछा किया जा सकता है ( DPF) ^{4, 5,}रेफरी "> ^{6, 7।}

इसके अलावा, उपर्युक्त चरणों में से प्रत्येक में विभिन्न जीनों की कार्यात्मक जरूरतों समन्वित रूप से zebrafish रेटिना में मूल्यांकन किया जा सकता है, अन्य कशेरुकी मॉडल है जिसमें जीन पीटा तकनीक के इस्तेमाल से उत्पन्न phenotypes एक से अधिक लाभ प्रदान करने ही पोस्टमार्टम पर मूल्यांकन किया जा सकता के ऊतकों तय की। विशेष रूप से, ट्रांसजेनिक लाइनों में जो हम कल्पना और रेटिना में संवाददाता transgenes के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी कर सकते का उपयोग करते हैं, हमें जीन अभिव्यक्ति है कि एक विशेष न्यूरोनल सेल प्रकार की उत्पत्ति underlies का अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। zebrafish के तेजी से विकास के कारण, इन घटनाओं के पूरे विकास की अवधि के दौरान देखे जा सकते हैं, जिससे न्यूरोनल सेल पहचान अधिग्रहण और सेल व्यवहार के संबंध में जीन की अभिव्यक्ति के अस्थायी महत्व में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

अंत में, इन तरीकों कुशलता प्रत्यारोपण के माध्यम से कल्पना की पीढ़ी के साथ zebrafish में, जीन समारोह के दो महत्वपूर्ण पहलुओं में अंतर्दृष्टि, जिसके परिणामस्वरूप में जोड़ा जा सकता है। सबसे पहले, एक दाता भ्रूण, जिसमें एक विशेष जीन नीचे गिरा दिया गया था, जबकि वे एक लेबल हटाया गया जंगली प्रकार के माहौल में विकसित से प्रतिरोपित कोशिकाओं की जांच, हमें एक सेल स्वायत्त ढंग से जीन समारोह के बारे में प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। इस पूर्वज कोशिकाओं वे सामान्य रूप में। यह व्यक्त कर रहे हैं पूर्वज है कि अब इन जीनों ^{4, 6} से कार्यात्मक प्रोटीन उत्पन्न कर सकते हैं के विकास के भाग्य परिणाम की परीक्षा द्वारा उदाहरण है भीतर रेटिना भाग्य निर्धारक कारकों के समारोह के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की ओर जाता ^{है, 8, 9।} इस दृष्टिकोण का उपयोग, हम पता चला है कि कई भाग्य निर्धारक कारक हैं (जैसे, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) सेल में कार्य-autonomously विशिष्ट रेटिना न्यूरोनल भाग्य ड्राइव करने के लिए; जीन अभिव्यक्ति की कमी मुख्य रूप से एक भाग्य स्विच, कि इस तरह के जीन पछाड़ना के साथ कोशिकाओं को एक वैकल्पिक सेल भाग्य ^{4, 6, 7, 10} अपनाकर व्यवहार्य रहने के लिए ले जाता है। दूसरे, इस तरह के प्रयोगों कैमेरिक का आकलन करने के लिए कैसे जंगली प्रकार पूर्वज व्यवहार करते हैं, जब वे अलग आनुवंशिक वातावरण के भीतर विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, गुम्मट कोशिकाओं के विकास को आम तौर पर एक गुम्मट में ब्याज (संवाददाता transgene) बनाम छेड़छाड़ मेजबान वातावरण (जैसे, जीन पीटा / पछाड़ना) के एक जीन व्यक्त की तुलना द्वारा, जीन अभिव्यक्ति और सेल भाग्य पर जिसके परिणामस्वरूप प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । मेजबान वातावरण में कुछ न्यूरॉन प्रकार की कमी है, उदाहरण के लिए, एक सेल गैर स्वायत्त ढंग से जंगली प्रकार पूर्वज व्यवहार को प्रभावित करने के लिए, उन्हें पूर्वाग्रह से underrepresented ओ में फर्क करने की दिशा में दिखाया गया हैन्यूरॉन प्रकार ^{4, 7, 11, 12} लापता आर। यह देखते हुए कि रेटिना न्यूरॉन्स क्रमिक रूप से समय पर विशिष्ट neuronal भाग्य निर्धारक जीनों की अभिव्यक्ति (भाग्य जीन अभिव्यक्ति) ⁽¹³ में समीक्षा) द्वारा एक संरक्षित histogenic क्रम में पैदा होते हैं, हम प्रदर्शित करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल कैसे जंगली प्रकार progenitors में भाग्य जीन अभिव्यक्ति के समय प्रभावित होता है जब इस तरह के पूर्वज प्रेरित न्यायपालिका सेलुलर रचनाओं के साथ रेटिना मेजबान वातावरण में विकसित करना। यहाँ, हम के लिए साक्ष्य के रूप में इन तरीकों रूपरेखा कैसे अपेक्षाकृत मानक और व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक के संयोजन रेटिना progenitors के विकास के ^{8, 9} में भाग्य जीन अभिव्यक्ति के समय की परीक्षा में सक्षम बनाता है।

इस प्रोटोकॉल के अनुसार की आसानी के साथ संयोजन के समय चूक इमेजिंग एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णनपूर्व vivo विकासशील zebrafish भ्रूण में प्रत्यारोपण के गठन व्यक्ति mosaically विकासात्मक retinogenesis की पूरी अवधि के दौरान लेबल की कोशिकाओं का पालन करें। कार्यात्मक जीन जोड़तोड़ प्रदर्शन करके या तो मेजबान भ्रूण, भ्रूण दाता, दोनों या न में, एक जीन समारोह की सेल स्वायत्तता का आकलन कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण किसी अन्य प्रणाली है जिसके लिए अलग-अलग यहाँ उल्लिखित घटकों उपयुक्त हैं में इसी तरह के अनुसंधान के सवालों के व्यापक रूप से अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और जानवरों के उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद संहिता के प्रावधानों के अनुसार बाहर किया गया और संस्थागत नैतिकता समितियो…

Representative Results

यह काम जब जंगली प्रकार रेटिना पूर्वज एक morphant मेजबान भ्रूण के भीतर विकसित जीन अभिव्यक्ति समय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रयोगात्मक मेजबान…

Discussion

समझना किस हद तक पड़ोसी कोशिकाओं महत्वपूर्ण सेल भाग्य का निर्धारण करने वाले कारकों की अभिव्यक्ति के समय को प्रभावित आवश्यक है जब कुशलता से भ्रूण या प्रेरित multipotent स्टेम कोशिकाओं को एक विशिष्ट बाद mitotic सेल…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6