In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

Summary

Live sporing av individuelle WT netthinnens stamfedre i forskjellige genetiske bakgrunn åpner for vurdering av bidraget fra celle non-autonome signalering under nevrogenese. Her ble en kombinasjon av gen knockdown, kimær generasjon via embryotransplantasjon og in vivo time-lapse konfokalt avbildnings anvendes for dette formål.

Abstract

De genetiske og tekniske styrker har gjort sebrafisk virveldyr en viktig modellorganisme hvor konsekvensene av genet manipulasjoner kan spores in vivo gjennom raske utviklingsperioden. Flere fremgangsmåter kan studeres inkludert celleproliferasjon, genekspresjon, cellemigrering og morfogenese. Viktigere, kan dannelsen av kimærer gjennom transplantasjoner lett utføres, slik at mosaikk merking og sporing av individuelle celler under påvirkning av vertsmiljøet. For eksempel ved å kombinere funksjonelle genet manipulasjoner av verten embryo (f.eks, gjennom morfolino mikroinjeksjon) og levende avbildning, effektene av ytre, celle nonautonomous signaler (gitt av den genmodifiserte miljø) på enkelt transplanterte donorceller kan vurderes. Her viser vi hvordan denne tilnærmingen brukes til å sammenligne utbruddet av fluorescerende transgene uttrykk som en proxy for timingen av cellen skjebne determinasjon i forskjellige genetiske vertsmiljøer.

I denne artikkelen gir vi protokollen for microinjecting sebrafisk embryo for å markere donorceller og for å føre genet knockdown i verts embryo, en beskrivelse av transplantasjon teknikk som brukes til å generere kimære embryoer, og protokollen for å forberede og kjøre in vivo time-lapse konfokalmikroskoper avbildning av flere embryoer. Spesielt utføre Fler bildebehandling er avgjørende når man sammenligner tidspunkt for hendelser som utbruddet av genuttrykk. Dette krever innsamling av data fra flere kontroll og eksperimentelle embryoer behandles samtidig. En slik tilnærming kan lett utvides for studier av ytre påvirkninger i ethvert organ eller vev av valg tilgjengelig for å leve bildebehandling, forutsatt at transplantasjoner kan være målrettet lett i henhold til etablerte embryonale skjebne kart.

Introduction

Evnen til å visualisere viktige utviklingsprosesser i en in vivo virveldyr har bidratt til at sebrafisk en viktig modell for å studere normal og sykdomstilstander (anmeldt i ^{1, 2).} Spesielt er det nevrale netthinnen en tilgjengelig del av det sentrale nervesystemet. Netthinnen gir seg enkelt utføre studier av nevrogenese på grunn av sin svært organisert, men likevel relativt enkel struktur, og sin svært konservert nevroner typer over arter virveldyr ^3. Dynamics of cellular atferd som spredning, cellesyklus exit, asymmetrisk celledeling, skjebne spesifikasjon, differensiering, og nevrale kretser dannelse kan følges gjennom hele prosessen med retinogenesis, som er gjennomført i den sentrale netthinnen av sebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Videre kan de funksjonelle kravene til forskjellige gener i alle de ovenfor nevnte trinn skal samtidig vurdert i sebrafisk hinnen, noe som gir en fordel fremfor andre virveldyr modeller hvori fenotyper som følge av anvendelsen av genet knockout teknikker kan bare bli vurdert ved obduksjon av fast vev. Spesielt er anvendelse av transgene linjer der vi kan visualisere og overvåke ekspresjon av fluorescerende proteiner som reporter-transgener i netthinnen, gjør det mulig å oppnå tidsoppløsning av genekspresjon som ligger under dannelsen av en bestemt neuronal celletype. På grunn av den raske utviklingen av sebrafisk, kan disse hendelsene visualiseres gjennom hele utviklingsperioden, og dermed gi dypere innsikt i det timelige betydningen av genuttrykk i forhold til nervecelle identitet oppkjøp og celle atferd.

Endelig kan disse metodene kan kombineres effektivt i sebrafisk med genereringen av kimæren via transplantasjoner, noe som resulterer i innsikt i to viktige aspekter av genfunksjon. For det første, å undersøke celler transplantert fra en donor embryo, i hvilken et bestemt gen er slått ned mens de utvikler i et umerket villtype miljø, gjør det mulig for oss å innhente relevant informasjon om genfunksjon i en celle-autonome måte. Dette fører til viktige innsikter om funksjonen til retinal skjebne bestemmende faktorer innenfor stamceller de er vanligvis uttrykt i. Dette er eksemplifisert ved undersøkelse av utviklings skjebne utfallet av stamfedre som ikke lenger kan generere funksjonell protein fra disse genene ^{4, 6, 8, 9.} Utnytte denne tilnærmingen, har vi vist at mange skjebne bestemmende faktorer (for eksempel Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handle celle-autonomously å kjøre spesifikke retinal nevronale skjebner; mangel på genekspresjon fører først og fremst til en skjebne bryter, slik at cellene med genet knockdown være levedyktig ved å innta en alternativ celle skjebne ^{4, 6, 7, 10.} For det andre kan slike kimære eksperimenter brukes til å vurdere hvordan villtype forfedre oppføre seg når de utvikler innen ulike genetiske miljøer. For eksempel, ved å sammenligne utviklingen av WT celler som vanligvis uttrykker et gen av interesse (og reporter transgenet) i et WT versus manipulert vert miljø (for eksempel genet knockout / knockdown), de resulterende virkninger på genekspresjon og celle skjebne kan vurderes . Mangelen på visse typer neuron i vertsmiljøet, for eksempel, har blitt vist å påvirke villtype progenitor oppførsel i en celle ikke-autonome måte, for å forspenne dem mot å differensiere til den underrepresented or mangler nevroner typer ^{4, 7, 11, 12.} Gitt at netthinnens nerveceller er født i en fredet histogenic rekkefølge etter sekvensielt timet uttrykket av spesifikke nevronale skjebne determinant gener (skjebne genekspresjon) (anmeldt i ^13), brukte vi disse metodene for å demonstrere hvordan timingen av skjebnen genuttrykk i villtype forfedre påvirkes når slike stamceller utvikler seg i netthinnens vertsmiljøer med induserte avvikende celle komposisjoner. Her skisserer vi disse tilnærmingene som bevis for hvordan kombinasjonen av relativt vanlige og brukte teknikker gjør det mulig for undersøkelse av timingen av skjebnen genuttrykk i utviklingen av netthinnens stamfedre ^{8, 9.}

Denne protokollen beskriver en eksperimentell tilnærming som kombinerer time-lapse bildebehandling med den enkle performing transplantasjon i ex vivo utvikle sebrafisk embryo å følge individuelle mosaically merkede celler i hele perioden med utviklings retinogenesis. Ved å utføre funksjonelle genet manipulasjoner enten i verten embryo, giver embryo, begge eller ingen av delene, kan man vurdere celle autonomi av genfunksjon. Denne fremgangsmåten kan tilpasses vidt til tilsvarende problemstillinger i hvilket som helst annet system hvor de individuelle komponentene som er beskrevet her er egnet.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i henhold til bestemmelsene i Australian National Health and Medical Research Council anbefaling for omsorg og bruk av dyr, og ble godkjent av institusjonelle etikkomiteer. 1. Utarbeidelse av Sebrafisk Voksen fisk sammenkobling Sett opp voksen fisk som par (eller to par) i riktig størrelse avl tanks kvelden før bruk. For å holde den kvinnelige skilles fra den mannlige, bruk en skillelinje å aktivere fisk å se, men ikke røre hver…

Representative Results

Dette arbeidet presenterer en forsøksprotokoll for å vurdere endringer i genuttrykk timing når villtype netthinnens stamfedre utvikle innenfor en morphant vert embryo. De eksperimentelle verts embryoer er Ptf1a morphants, som mangler de mellomliggende født horisontale og amacrine interneurons i netthinnen 7, 26. Disse har blitt sammenlignet med kontrollverts embryoer, som ble injisert med en standard kontroll morfolino. <…

Discussion

Forstå hvilken grad nabocellene påvirke tidspunktet for uttrykk av avgjørende celle skjebne avgjørende faktorer er viktig når du tar sikte på å effektivt instruere embryonale eller induserte multipotent stamceller til å differensiere i en bestemt post-mitotisk celletype eller mønstrede vev. Videre undersøke disse molekylære hendelser i utviklings cellene i levende dyr gir relevant dynamisk (temporal og romlig) informasjon om den bestemte cellulære sammenhenger knyttet til disse hendelsene i vivo til…

Materials

Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6