Turbidimetri on Human vaskede blodplader: Virkningen af Pannexin1-inhibitoren Brilliant Blue FCF på Collagen-induceret aggregering
Summary
Vi beskriver en enkel fremgangsmåde til isolering af vaskede blodplader fra humant blod efterfulgt af agonist-induceret blodpladeaggregering målinger ved turbidimetri. Som eksempel anvender vi denne metode til undersøgelse af aggregeringsrespons af humane blodplader til collagen efter en præ-inkubation med Pannexin1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri er et laboratorium teknik, der anvendes til at måle aggregation af blodplader suspenderet i enten plasma (blodpladerigt plasma, PRP) eller i puffer (vaskede blodplader), ved anvendelse af en eller en kombination af agonister. Anvendelsen af vaskede blodplader adskilt fra deres plasma miljø og i fravær af antikoagulanter muliggør studere iboende blodplade egenskaber. Blandt de stort panel af agonister, arachidonsyre (AA), adenosin-diphosphat (ADP), thrombin og kollagen er den hyppigst anvendte. Den aggregeringsrespons kvantificeres ved måling af den relative optiske densitet (OD) over tid af blodpladesuspension under kontinuerlig omrøring. Blodplader i homogen suspension begrænse passagen af lys efter tilsætning af en agonist, forekommer blodplade formændring fremstilling af en lille forbigående stigning i OD. Efter denne indledende aktiveringstrin, blodplade blodpropper danner gradvist, tillader passage af lys gennem suspensionen som en result af nedsat OD. Aggregeringsprocessen til sidst udtrykkes som en procentdel i forhold til OD af blodpladefattig plasma eller puffer. Streng kalibrering er derfor vigtigt i starten af hvert forsøg. Som en generel regel: kalibrering til 0% er indstillet ved at måle OD af en ikke-stimuleret blodplade suspension, medens måling af OD af suspensionen indeholdende ingen blodplader repræsenterer en værdi på 100%. Blodpladeaggregering almindeligvis visualiseret som en tidstro aggregeringskurven. Turbidimetri er en af de mest almindeligt anvendte laboratoriemetoder til undersøgelse af blodpladefunktion og betragtes som det historiske guldstandard og anvendes til udvikling af nye farmaceutiske midler rettet mod inhibering af blodpladeaggregering. Her beskriver vi detaljerede protokoller for 1) fremstilling af humane vaskede blodplader og 2) turbidimetrisk analyse af kollagen-induceret aggregering af humane vaskede blodplader forbehandlet med fødevarer farvestof Brilliant Blue FCF, der var for nylig identified som en inhibitor for Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Blodplader er afgørende blodkomponenter og hovedfunktion-sammen med koagulationsfaktorer-er at stoppe blødning efter blodkarbeskadigelse. Blodplader er små (2-3 um) anuclear fragmenter afledt megakaryocytter i knoglemarven 1. Blodplader cirkulerer i ikke-aktiveret tilstand, hvor de vises som linseformede strukturer. Ved afbrydelse af endotelet, blodplader samles til stedet med blodkarbeskadigelse at tilslutte hullet, en proces, der kaldes primær hæmostase. Indledningsvis, blodplader tillægger subendoteliale molekyler, såsom collagen og von Willebrand-faktor, der er udsat som følge af skade-adhæsion trin 2. Derefter kan de ændrer form og udskiller kemiske budbringere-aktiveringstrin. Endelig har de forbindelse til hinanden ved at slå bro receptorer-aggregering trin. Primær hæmostase efterfølges af en sekundær proces, der involverer aktivering af koagulationskaskaden med fibrinaflejring, som stabilisererr den indledende thrombe 2.
Akutte iskæmiske hændelser, såsom myocardieinfarkt 3 resulterer ofte fra thrombi, der danner grund af fysisk afbrydelse (sprængning) af en aterosklerotisk plak. Aktuelle trombocythæmmende lægemidler er hjørnestenen i behandlingen af denne udbredte sygdom, men deres kliniske fordel er begrænset af en øget risiko for blødning. De mest ordinerede lægemidler i kardiovaskulære patienter, aspirin og anti-P2Y12 forbindelser målrette thromboxan A2 og ADP veje 4 henholdsvis som er de vigtigste veje, der fører til blodpladeaktivering. Men innovativ forskning i retning af nye mål, der optimalt ville balancere antitrombotiske effekter og hæmoragisk risiko er stadig nødvendigt.
Fra 1960'erne 5 til dag, har turbidimetrisk aggregometri spillet en afgørende rolle inden for forskning, forbedre vores viden om trombocytreaktivitet og jegn overvågning af styrken af antithrombotiske reagenser i mennesker. Turbidimetri blev oprindeligt anvendt til PRP ekstraheret fra blodprøver. Faktisk blodtapning udført i rør indeholdende citrat giver hurtig og stor produktion af PRP uden at have nogen virkning på blodplade integritet og funktion. Men den kortsigtede stabilitet (ca. 3 h), PRP og de resterende plasmatiske enzymer, såsom thrombin, og koncentrationen lavt calciumindhold forbundet med potentielt kulturgenstandsspor sammenlægning profiler er af væsentlig ulempe for anvendelsen af PRP. Et vigtigt skridt fremad har været udviklingen af en fremgangsmåde til blodplade isolering med yderligere centrifugering og vask trin 6. Kort sagt er PRP isoleret fra fuldblod opsamlet på syre-citrat-dextrose (ACD) og blodplader isoleret efter seriel centrifugeringstrin inden de resuspenderes i en iso-osmotisk phosphatpuffer (Tyrodes puffer) indeholdende glucose, humant serumalbumin og divalent ctioner (Ca2 + og Mg2 +). For at undgå ændringer i trombocytreaktivitet pH af Tyrodes puffer omhyggeligt holdt ved 7,35-7,4. Desuden er uønsket aktivering af blodplader forhindres ved tilsætning af prostacyclin (PGI2) før nogle centrifugeringstrin. Endelig tilsætning af apyrase forhindrer vaskede blodplader bliver resistente mod virkningen af ATP / ADP. Den resulterende blodpladesuspension mangler koagulerende faktorer og stabiliteten af blodplader forøget med mindst to gange sammenlignet med PRP løsninger. Desuden den omstændighed, at blodplader er inaktive, men intakte warrants reproducerbarheden af turbidimetriske målinger og giver mulighed for at studere virkningen af agonister eller antagonister af blodpladeaggregering på en optimal måde.
Under anvendelse af denne metode har vi vist i en nylig undersøgelse, at inhibering af dannelsen af Panx1 kanaler ved en genetisk tilgang (knock-out-mus) eller faldende Panx1 kanalaktivitet ved farmakologisktilgange reduceret collageninduceret blodpladeaggregering 7. Panx1 danner ATP-frigivelse kanaler som ubikvitært udtrykt i mange celletyper, herunder humane blodplader 7, 8. Faktisk, vi demonstreret ved turbidimetri på humane vaskede blodplader at en 7 min præinkubation med et panel af mere eller mindre specifikke kemiske blokkere (probenecid, mefloquin og 10 Panx1 peptider) forud for tilsætning af forskellige agonister, inhiberede specifikt collageninduceret blodpladeaggregation mens blodplade reaktioner på AA og ADP ikke blev påvirket. Vi påvist, at ATP frigivelse gennem Panx1 kanaler specifikt interfererer i GPVI signalering, der fører til collagen-induceret aggregering. Interessant, flere FDA-godkendte forbindelser med anvendelser i andre sygdomme (probenecid, mefloquin) påvirke aktiviteten af Panx1 kanaler i blodplader. På den ene side er dette åbner nye terapeutiske perspektiver for at vælgeively modificere trombocytreaktivitet. På den anden side bør man overveje potentielle sekundære virkninger af disse forbindelser. I den forbindelse sikre fødevarer farvestof Brilliant Blue FCF bruges i flere slik og energidrikke er blevet beskrevet som en selektiv inhibitor af Panx1 9. Vi beskriver her en protokol til isolering af humane vaskede blodplader og turbidimetriske målinger af blodpladeaggregering er indrettet til at undersøge virkningen af den Brilliant Blue FCF farvestof som en antagonist af blodpladeaggregering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er stor interesse for at finde nye lægemidler kan modulere trombocytfunktionen for at forhindre blodpropper uden at øge risikoen for blødning. Til dette formål in vitro laboratorieforsøg, som pålideligt og reproducerbart kan overvåge aggregeringsresponser i humane blodplader er absolut nødvendige. Turbidimetrisk aggregometri er en nem teknik til at udføre. Men har brug for nogle forholdsregler, der skal holdes for øje. Målingerne skal udføres under kontinuerlig omrøring som aggregeringen proces…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (310030_162579 / 1 til Brenda Renata Kwak og 320030_144150 til Pierre Fontana) samt af en bevilling fra den schweiziske Hjerteforeningen.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
