コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を
Summary
我々は、比濁法によるアゴニスト誘導性血小板凝集の測定に続いてヒト血液からの洗浄した血小板を単離するための簡単な方法を記載します。一例として、我々は、ブリリアントブルーFCF Pannexin1チャネル阻害剤とのプレインキュベーション後にコラーゲンをヒト血小板の凝集応答を研究するため、この方法を適用します。
Abstract
濁度は、1つの使用またはアゴニストの組み合わせにより、血漿（多血小板血漿、PRP）又は緩衝液（洗浄血小板）のいずれかに懸濁した血小板の凝集を測定するために適用される実験室技術です。洗浄血小板の使用は、そのプラズマ環境から分離し、抗凝固剤の不存在下で固有の血小板の性質を研究することができます。アゴニストの大型パネル、アラキドン酸（AA）のうち、アデノシン二リン酸（ADP）、トロンビンおよびコラーゲンは、最も頻繁に使用されます。凝集反応は、連続撹拌下で血小板懸濁液の経時的な相対光学密度（OD）を測定することによって定量化されます。均質な懸濁液中の血小板は、アゴニストの添加後の光の通過を制限し、血小板の形状の変化はODの小さな一時的な増加を生成生じます。この最初の活性化段階に続いて、血小板血栓は、RES、懸濁液を通る光の通過を可能にし、徐々に形成します減少したODのULT。凝集プロセスは、最終的に血小板に乏しい血漿または緩衝液のODと比較し、パーセンテージとして表現されます。厳格なキャリブレーションは、各実験の開始時にこれが不可欠です。 0％に較正ない血小板を含まない懸濁媒体のODを測定しながら、非刺激血小板懸濁液のODを測定することによって設定された100％の値を表す：一般的なルールは次のように。血小板凝集は、一般的にリアルタイム集計曲線として可視化されます。比濁法は、血小板機能の調査のための最も一般的に使用される実験技術の一つであり、歴史的なゴールドスタンダードとみなされ、血小板凝集を阻害することを目的とし、新たな医薬品の開発に使用されます。ここでは、人間の準備が血小板を洗浄し、2）人間のコラーゲン誘発凝集の比濁分析は、最近のiDENた食用色素ブリリアントブルーFCFで前処理した血小板を洗浄し、1）詳細なプロトコルを記述しますPannexin1（Panx1）チャネルの阻害剤としてtified。
Introduction
血小板は血液や血管損傷後の出血を止めるために凝固-ある要因とその主な機能は、一緒の重要なコンポーネントです。血小板は、骨髄1の巨核球に由来する小さな（2-3μm）の無核の断片です。血小板は、その間にそれらがレンズ状構造として現れる、非活性状態で循環します。内皮の中断時には、血小板は穴、一次止血と呼ばれるプロセスをプラグインする血管損傷部位に集まります。最初に、血小板は損傷接着ステップ2の結果として公開され、コラーゲンおよびフォンビルブラント因子としてサブ内皮分子に取り付けます。その後、彼らは形状を変更し、化学的メッセンジャー活性化工程を分泌します。最後に、彼らは、受容体 – 凝集工程をブリッジによって互いに接続されています。一次止血を安定化フィブリン沈着と凝固カスケードの活性化を含む二工程、続いて初期血栓2よ。
例えば心筋梗塞3などの急性虚血性イベントは、しばしばアテローム硬化性プラークの物理的破壊（破裂）の形態血栓に起因します。現在の抗血小板薬は、この広範囲の疾患の治療の基礎ですが、その臨床的有用性は、出血のリスクの増大によって制限されています。心血管患者、アスピリンや抗P2Y12化合物の中で最も処方薬は、トロンボキサンA2および血小板の活性化につながる主要な経路は、それぞれ、ADP経路4を 、ターゲットにしています。しかし、最適な抗血栓効果と出血性リスクのバランスを取るだろう新たな目標に向けた革新的な研究は依然として必要です。
1960 5から今日まで、比濁凝集は、血小板反応性と私の知識を高め、研究に重要な役割を果たしてきましたヒトにおける抗血栓剤の効力のモニタリングをNです。濁度測定は、最初の血液サンプルから抽出されたPRPに適用しました。確かに、クエン酸を含むチューブで行われる採血は、血小板の完全性と機能上の任意の影響を与えることなく、PRPの迅速かつ大規模な生産を可能にします。しかし、PRPとトロンビンのような残りの血漿酵素の短期安定性（約3時間）、そして潜在的に人為的凝集プロファイルに関連付けられた低カルシウム濃度は、PRPの使用のための主要な不便です。重要な前進は、追加の遠心分離および洗浄工程6と血小板の単離のための方法の開発でした。等浸透圧リン酸バッファー（タイロード緩衝液）を含むグルコース、ヒト血清アルブミン及び二価のC中に再懸濁される前に要するに、PRPは、酸 – クエン酸塩 – デキストロース（ACD）に採取した全血から単離され、血小板がシリアル遠心分離工程の後に単離されますations（のCa 2+およびMg 2+）。血小板反応性の変化を避けるために、タイロード緩衝液のpHは7.35から7.4に慎重に保たれています。また、血小板の望ましくない活性化は、いくつかの遠心分離工程の前にプロスタサイクリン（PGI 2）を添加することによって防止されます。最後に、アピラーゼの添加は、ATP / ADPの作用に対して耐性になってからの洗浄血小板を防止します。得られた血小板懸濁液は、凝固因子を欠き、PRPソリューションと比較して、血小板の安定性は少なくとも2倍増加します。血小板が比濁測定の再現性不活性であるが、無傷のワラントであり、最適な方法での血小板凝集のアゴニストまたはアンタゴニストの作用を研究する能力を提供することに加えて、実際。
この方法を使用して、我々は、遺伝的アプローチ（ノックアウトマウス）でPanx1チャネルの形成を阻害または薬理学的によりPanx1チャネル活性を低下させることが最近の研究で示されました減少したコラーゲン誘発血小板凝集7に近づきます。 Panx1は遍在ヒト血小板7、8を含む多くの細胞型において発現されるATP放出チャネルを形成します。ヒト阻害種々のアゴニストの添加に先立って多かれ少なかれ特定の化学ブロッカー（プロベネシド、メフロキン及び10の Panx1ペプチド）のパネルとの7分間のプレインキュベーションは、具体的にはコラーゲン誘発こと血小板を洗浄に実際に、我々は、比濁法によって実証しました血小板凝集AAおよびADPへの血小板応答は影響を受けなかった一方で。私たちは、Panx1のチャネルを通じてATP放出は、特にコラーゲン誘発凝集につながるGPVIのシグナル伝達経路に干渉することを実証しました。興味深いことに、他の疾患（プロベネシド、メフロキン）中のアプリケーションと複数FDA承認化合物は、血小板におけるPanx1チャネルの活性に影響を与えます。一方で、これは、選択するために新たな治療展望を開きますively血小板反応性を修正します。一方、1は、これらの化合物の潜在的な二次的影響を考慮する必要があります。この文脈では、安全な食品染料ブリリアントブルーFCFはPanx1 9の選択的阻害剤として記載されている複数のキャンディーやエネルギードリンクに使用します。ここでは、血小板凝集のアンタゴニストとしてブリリアントブルーFCF色素の効果を調査するために適合され、ヒト洗浄血小板および血小板凝集の比濁測定を単離するためのプロトコルを記述しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
出血のリスクを高めることなく、血栓症を防ぐために、血小板機能を調節することができる新薬の発見に大きな関心が寄せられています。この目的のために、確実かつ再現ヒト血小板に集約応答を監視することができin vitroの実験室でのテストは絶対に必要です。比濁凝集を行うための簡単なテクニックです。しかし、いくつかの注意が念頭に置いておく必要があります。測定は、凝?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スイス国立科学財団からの助成金（ピエール・フォンタナに310030_162579 /ブレンダ・レナータクァクに1と320030_144150）などにより、スイス心臓財団からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
