Summary
Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.
Abstract
Türbidimetrik birine ait kullanım ya da agonist bir kombinasyonu ile (yıkanmış trombositler), ya plazma (platelet bakımından zengin plazma, PRP) 'de ya da tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi, trombosit agregasyonunu ölçülmesi için tatbik edilen bir laboratuar tekniğidir. plazma ortamından ve antikoagülan yokluğunda ayrılır, yıkanır platelet kullanımı içsel trombosit özelliklerini incelemek için izin verir. agonistleri, arakidonik asit (AA), adenozin, di-fosfat (ADP), büyük panelin arasında, trombin ve kollajen en sık kullanılanlardır. agregasyon yanıtı sürekli karıştırma altında trombosit süspansiyonu zamanla görece optik yoğunluk (OD) ölçerek belirlenir. Homojen süspansiyon içinde trombositler bir agonistin eklenmesinden sonra ışığın geçişini sınırlandırmak, trombosit şekil değişimi OD küçük geçici artış meydana oluşur. Bu ilk Aktivasyon aşamasından sonra, trombosit pıhtıları, res olarak süspansiyon içinden ışığın geçmesine izin veren, yavaş yavaş meydanave ön muamele OD azalmıştır. toplama işlemi sonunda, trombosit bakımından fakir plazma ya da tampon OD ile karşılaştırıldığında, bir yüzde olarak ifade edilir. Titiz kalibrasyon her denemenin başında dolayısıyla esastır. Genel bir kural olarak: Kalibrasyon% 0 hiçbir trombositlerden oluşan süspansiyon ortamının OD ölçümü% 100 arasında bir değere temsil ederken olmayan bir uyarılan platelet süspansiyonu OD ölçümü ile ayarlanır. Trombosit agregasyonu, genellikle gerçek zamanlı agregasyon eğrisinin olarak görülür. Türbidimetrik platelet fonksiyonunun incelenmesi için en yaygın olarak kullanılan laboratuar tekniklerinden biridir ve tarihi altın standart olarak kabul edilir ve platelet toplanmasını inhibe etmeyi hedefleyen yeni farmasötik maddelerin geliştirilmesi için kullanılır. Burada, insan hazırlanması yıkanmış plateletler ve insan kolajen kaynaklı agregasyonun 2) türbidimetrik analiz trombositler son kimliklerini olduğu gıda boyası Parlak Mavi FCF ile ön işleme tabi tutulmuş, yıkanmış) 1 için ayrıntılı protokoller tarifPannexin1 (Panx1) kanallarının bir inhibitörü olarak tified.
Introduction
Trombositler, kan ve pıhtılaşma ile ana işlevi-birlikte önemli bileşenleridir, kan damar hasarı sonrası kanamayı durdurmak için faktörlerin-olduğunu. Trombositler, kemik iliği 1 megakaryosit türetilmiş küçük (2-3 um) nukleussuz fragmanlarıdır. Trombositler ve bu süreçte mercek şeklinde yapılar olarak görünür, aktif olmayan halde dolaşır. endotelyumdaki kesinti üzerine, trombosit delik, birincil hemostaz adı verilen bir işlem takmak için kan damarı hasar bölgesinde toplanır. Başlangıçta, trombositler yaralanma yapışma aşama 2'de bir sonucu olarak maruz kollajen ve von Willebrand faktörü gibi bir alt endotelial moleküller, ekleyin. Sonra, şekil değiştirebilir ve kimyasal haberciler-aktivasyon aşamasını salgılar. Son olarak, reseptörleri toplanma aşaması köprü ile birbirine bağlanır. Primer hemostaz stabilize fibrin birikimi, pıhtılaşma aktivasyonu kapsayan bir ikincil işlem takip ederBaşlangıç trombus 2 s.
Miyokardiyal enfarktüs 3 olarak akut iskemik olaylar nedeniyle sıklıkla bir aterosklerotik plak fiziksel parçalama (kopma) arasında meydana trombusları. Güncel antiplatelet ilaçlar bu yaygın hastalığın tedavisinde temel taşlarıdır ancak klinik yarar kanama riskinde artış ile sınırlıdır. Kardiyovasküler hastalarda, aspirin ve anti-P2Y12 bileşikleri en çok önerilen ilaçlar, tromboksan A2 ve trombosit aktivasyonu giden ana yollar sırasıyla ADP yollar 4, hedef. Ancak, optimum antitrombotik etkileri ve hemorajik riski dengelemek olurdu yeni hedeflere doğru yenilikçi araştırmalar hala gereklidir.
Bugüne 1960'lardan 5 itibaren, türbidimetrik agregometri trombosit reaktivitesi ve i bilgimizi arttırmak, araştırma önemli bir rol oynamıştırİnsanlarda anti-trombotik reaktiflerin potansiyelinin kontrolü n. Türbidimetrik ilk kan örneklerinden ekstrakte PRP uygulanmıştır. Gerçekten de, kan toplama sitrat trombosit bütünlüğü ve işlevi üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmaksızın PRP hızlı ve büyük üretimine izin verir içeren tüpler içerisinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, PRP kısa süreli kararlılık (yaklaşık 3 saat) ve trombin gibi kalan plazmatik enzim, ve potansiyel olarak artefakt agregasyon profilleri ile bağlantılı düşük kalsiyum konsantrasyonlu PRP kullanımı için önemli bir rahatsızlık vardır. Önemli bir ilerleme ek bir santrifüjleme ve yıkama 6 numaralı adımları ile trombosit izolasyonu için bir yöntemin geliştirilmesi olmuştur. bir izo-ozmotik bir fosfat tamponu (Tyrode tamponu) içeren glikoz, insan serum albumini ve iki değerli c tekrar askıya alınmadan önce Kısacası, PRP asit sitrat dektroz (CD) üzerinde alınan tam kandan izole edilir ve trombosit seri santrifüj aşamasından sonra izole ediliralar (Ca2 + ve Mg2 +). trombosit reaktivite değişiklikleri önlemek için, Tyrode tamponu pH dikkatli bir şekilde 7.35-7.4 tutulur. Ayrıca, trombositlerin arzu edilmeyen aktivasyonunun, bir santrifüj aşamasından önce (PGI2) prostasiklin ilave edilerek baskılanmaktadır. Son olarak, apiraz eklenmesi ATP / ADP etkisine karşı dirençli hale gelen yıkanmış trombositler engeller. Elde edilen trombosit süspansiyonu pıhtılaştırıcı faktörler sahip değildir ve PRP çözümlere kıyasla gibi platelet stabilitesi, en azından iki kat artar. Buna ek olarak, trombositler aktif olmayan fakat sağlam garanti eder türbidimetrik ölçümlerin tekrarlanabilirlik ve aslında optimal bir şekilde agonistleri veya trombosit agregasyon antagonistlerinin işlem çalışma olanağı sağlar.
Bu yöntemi kullanarak, son çalışmada göstermiştir ki, bir genetik yaklaşım Panx1 kanallarının oluşumunu inhibe etmek (knock-out fareler) ya da farmakolojik ile Panx1 kanal aktivitesini azaltarakindirgenmiş kolajen ile uyarılan platelet birikmesini 7 yaklaşır. Panx1 her yerde bulunan bir insan trombositleri 7, 8 de dahil olmak üzere bir çok hücre tipinde ifade edilir, ATP-salım kanalları oluşturur. İnsan inhibe çeşitli agonistlerin ilavesinden önce daha çok ya da daha az spesifik kimyasal blokerleri (probenesid, meflokin, 10 Panx1 peptitler) bir panelin bir 7 dakika ön inkübasyon, kolajen ile uyarılan bu yıkanmış plateletler üzerinde Aslında, bulanıklık derecesi gösterdi platelet agregasyon AA ve ADP trombosit tepkileri etkilenmemektedir. Biz Panx1 kanallardan ATP salma, kolajen ile uyarılan agregasyonuna yol açan GPVI sinyalleme yolağında müdahale olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, başka hastalıkların (probenesid, meflokin) uygulamaları ile birden çok FDA onaylı bileşikler trombositlerde Panx1 kanallarının aktivitesini etkiler. Bir yandan, bu seçmek için yeni terapötik perspektifler açıyoryanıtını verdiler trombosit reaktivitesi değiştirin. Öte yandan, bir bu bileşiklerin potansiyel ikincil etkilerini dikkate almalıdır. Bu bağlamda, güvenli gıda boyası Parlak Mavi FCF Panx1 9 seçici bir inhibitörü olarak tarif edilmiştir birden fazla şeker ve enerji içecekleri kullanılır. Burada bir trombosit agregasyon antagonisti olarak Parlak Mavi FCF boya etkisini araştırmak üzere uyarlanmış insan yıkanmış trombositler ve trombosit agregasyon türbidimetrik ölçümleri izolasyonu için bir protokol açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beş ilgisiz sağlıklı gönüllüler trombosit izolasyon ve kümelenme testleri için kan örneği almak için alınmıştır. Yazılı onayları alınmıştır ve protokol Cenevre Üniversitesi Hastaneleri'nin Merkez Etik Komitesi tarafından onaylandı. sertifikalı Tüm gönüllüler sağlıklı olmak için ve deneyler öncesinde en az 10 gün boyunca herhangi bir trombosit müdahale ilaçları almamış etmek.
İnsan Kan Toplama 1. Tampon Hazırlama ve Yıkanmış Trombosit İzolasyonu
- (Cı-6H 8 O 7 • H2O, 66.6 mM), 2.5 gr trisodyum sitrat dihidrat (Na3 C6 H5 1.4 g sitrik asit monohidrat çözülmesiyle asit sitrat dektroz (CD) bir 100 ml sulu çözelti hazırlayın O 7 • 2 H2O, 85 mM) ve susuz D (+) 2 g - glikoz ihtiva eder. Çözeltinin pH değeri yaklaşık 4.5 olan.
- Şöyle Tyrode tampon için stok çözelti hazırlayın
- , Nispi final konsantrasyon 2.73 M, 238 53.6 mM olan, 10 g NaHCC 3 ve 0.58 g NaH2 4 * H damıtılmış H2O 500 mL 2 O 80 g NaCl, 2 g KCI çözülmesiyle stok çözelti hazırlayın 1 mM ve 8.4 mm. 4 ° C'de çözelti tutun.
- O 4 ° C'de çözüm tutun H2 damıtılmış 500 ml içinde 10.15 g MgCl2 x 6 H2O (100 mM) eritilmesi ile stok solüsyonu 2 hazırlayın.
- 10.95 g O, 4 ° C 'de çözüm tutun 2 O 500 ml damıtılmış H2 (100 mM) CaCl2 * 6H eritilerek stok çözelti 3 hazırlanır.
- 136,5 mM NaCl, 2.68 mM KCI, nihai konsantrasyonlara karşılık gelir Bu damıtık H2O ile 50 mL'lik bir son hacim içinde stok çözeltisi 1 2.5 mL seyreltilerek Tyrode tamponu hazırlayın 11.9 mM NaHCOj 3 ve 0.42 mM NaH2? 4 * H2O 7.35 pH ayarlamak ve 0.22 um f filtre edilerek sterilizeiltrelerini.
- 5 ml stok çözeltisi 1 seyreltilmesi ile Tyrode albümin% 0.35 tamponu (TA tamponu 7) hazırlanması, stok çözeltisi 2, 1 mL stok solüsyonu 3, 0.5 mL 1 M HEPES, 200 g / L, insan serum albümini, 1.8 ml 2 ml ve susuz D (+) 0.1 g - 100 mL'lik nihai bir hacim içinde glükoz damıtık H2O
- 1 N HCI ile 7,35 pH ayarlama ve damıtılmış H2O (toplam hacmin% 10) eklenmesi ile 295 mOsm / L ozmolarite ayarlayın. Bu çözelti içinde nihai konsantrasyonları şunlardır: 124 mM NaCI, 2.44 mM KCI, 10.82 mM NaHCOj 3, 0.38 mM NaH2? 4 * H2O, 0.91 mM MgCl2 x 6 H2O, 1.82 mM CaCl2 * 6 H2O . tüm deney boyunca 37 ° C 'de TA tamponu tutun.
2. Kan Toplama
- Con 50 ml tüplere, bir 19 G iğne ve bir ya da düşük turnike kullanılarak antekubital damardan, venöz kan 45-50 mL toplamak(Kan 6 hacim 1 hacim ACD) ettirilmesi ACD antikoagülan. trombin ve doku faktörü yok etmek için kan ilk 1-2 mL atın.
- Toplandıktan sonra yavaşça tersini tüp ACD ile kan karıştırın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca örnek inkübe.
İnsan 3. Bileşik Trombositler Yıkanmış
- 37 ° C'ye kadar santrifüj önceden ısıtın. Bütün santrifüjleme aşamaları aşağıda bu sıcaklıkta gerçekleştirilir.
- 13 dakika PRP elde etmek için 250 x g'de 15 ml tüpler (tüp başına 5 mL) ve santrifüj toplanmış kan gönderir.
Not: Örnek üç tabakadan üretimindeki bu santrifüjleme aşaması sonucu: 1) üst tabaka, plazma, trombositler oluşur ve beyaz kan hücrelerinin çok küçük bir bölümü. 2) ara tabaka, beyaz kan hücreleri açısından zengin bir bölümü. 3) esas olarak kırmızı kan hücrelerinden oluşur alt tabaka. - Üst la pipetleme PRP toplayınYer dikkatli bir şekilde maksimum kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübasyona yeni bir 15 mL tüpe.
- (5 ml PRP) 12 dakika boyunca 2200 x g'de PRP santrifüjleyin.
NOT: Bu santrifüj aşaması düşük frenle veya frensiz yapılmalıdır. - Süpernatant (trombosit bakımından fakir plazma) çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir plastik pastör pipeti kullanılarak, heparin 2 uL / mL içeren ta tamponu, 10 mL (5000 U / ml) ve 25 uM PGI2 2.5 uL / mL pelletini. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- (Düşük fren veya fren olmadan) 1,900 x g'de 8 dakika boyunca 25 uM PGI2 ve santrifüj 2.5 uL / mL ekleyin.
- Süpernatantı ve bir plastik pastör pipeti kullanılarak 25 uM PGI2 2.5 uL / mL içeren 5 ml ta tamponu ile pelletini. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- İnkübasyon sırasında, trombosit süspansiyonu 150 uL pipetleyinve 1.5 ml tüp otomatize hücre sayacı (bu doğru akım direnci değişiklikleri ölçerek kan hücrelerinin boyutunu tespit eder) kullanılarak, trombositler sayısı.
- 10 dakika inkübasyondan sonra, trombosit süspansiyonuna 25 uM PGI2 2.5 uL / mL eklemek ve hemen sonra 8 dakika boyunca 1.900 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı ve ta tamponu yeterli bir hacmi ile 250.000 trombosit / uL bir konsantrasyona pelletini U 0.01 apiraz 32 uL / mL ihtiva eden (hücre sayısı uL 500.000, 10 ml ta tamponu içinde tekrar süspansiyon yani ise) / ml (son konsantrasyon, 0.32 U / ml).
Not: apiraz yüksek konsantrasyonu agonistleri yokluğunda, ATP 10, 11 kendiliğinden salgılanmasıyla oluşan P2X1 reseptörlerinin desensitizasyon önlemek için kullanılır. Kollajen ile indüklenen tepkileri hızlı parakrin ile uyarılmaktadır Bu önemlidir, çünkü / ATP tarafından P2X1 otokrin aktivasyon fr yayımlananom trombosit aktive. trombosit sinyal yolu kritik P2X1 fonksiyonunun korunmasına gerektirmez ise, 0.02 U / ml apiraz kullanın. (Mahaut-Smith ve ark., 10 gözden) çeşitli çalışmalar 0.02 U / ml apiraz ihmal edilebilir P2X1 yanıtlarla ADP reseptör P2Y1 duyarsızlaştırma engellediğini göstermiştir. - aggregometric ölçümleri yapılmadan önce, 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe edin. Hazırlama 5 ile 8 saat boyunca stabildir.
4. agregometri
- Tyrode tampon içinde fibrinojen (56 mg / ml) hazırlayın.
- Cam küvet içine trombosit süspansiyonu pipetleyin 260 uL (Şekil 1A, sol küvet) - bekletme oyuklarında, bu 37 ° C 'de 3 dakika 10 fibrinojen uL (56 mg / ml) ve bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, daha sonra 2 süspansiyonu inkübe agregometre (Şekil 1B ve 1C) içinde.
- Panx1 ile önceden kuluçkayaönleyicisi Parlak Mavi ÜİT 37 ° C 'de, 7 dakika için 2.8 mM veya 28 mM stok çözeltisi (nihai konsantrasyon 100 uM ve 1 sırasıyla mM), 10 uL eklenmesiyle gerçekleştirilebilir.
- 10 uL fibrinojen (56 mg / ml), trombositler olmadan 10 uL Parlak Mavi FCF (2.8 mM veya 28 mM) ve TA tamponu ihtiva eden bir küvete OD'si ölçülerek, bir varsayımsal% 100 agregasyon değerine agregometre kalibre edin.
- Bir toplama de altında otomatik olarak karıştırıldı küvet yerleştirilir ve (agregasyon da 1 kullanılırsa, örneğin, pres F1) agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmesine basın.
NOT: Aşağıda açıklanan Bu deney Parlak Mavi ÜİT içerir. Kalibrasyon için kullanılan bileşik deney koşulu için ayarlanmalıdır.
- Bir toplama de altında otomatik olarak karıştırıldı küvet yerleştirilir ve (agregasyon da 1 kullanılırsa, örneğin, pres F1) agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmesine basın.
- Otomatik karıştırma altında deney için kullanılacak olan aynı trombosit örnek kullanarak, bir varsayımsal% 0 agregasyon değerine agregometre kalibreg.
- İyi bir araya getirilmesinde küvet koyun ve agregometre bağlantılı bilgisayarın klavyesinde karşılık gelen düğmeye basın. Devam etmeden önce yaklaşık 20-30 sn bekleyin. Bu gecikme hiçbir toplama agonistleri eklemeden önce olur sağlamak için hizmet vermektedir.
Not: trombosit sayısında herhangi bir fark ölçülen OD üzerinde bir etkiye sahip gibi,% 0 kalibrasyon adımı, her bir ölçüm için tekrar edilmesi gerekmektedir.
- İyi bir araya getirilmesinde küvet koyun ve agregometre bağlantılı bilgisayarın klavyesinde karşılık gelen düğmeye basın. Devam etmeden önce yaklaşık 20-30 sn bekleyin. Bu gecikme hiçbir toplama agonistleri eklemeden önce olur sağlamak için hizmet vermektedir.
- küvet içine, (75 uM son), araşidonik asidin arzu edilen agonist 20 uL, örneğin 15 ug / ml kolajen (1 ug / mL nihai) ya da 1.125 mM ekleyin. Hemen agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmeye basarak sürekli otomatik karıştırma altında kayıt başlar.
Not: agonist ilave trombosit aktivasyonuna yol açar. Trombosit agregalar açık deneyde (Şekil 1A sonunda cam küvet içinde ayırt edilebilir; Right küvet). - kayıt otomatik 6 dakika sonra durur. Bu noktada, bilgisayarın tasarruf simgesine tıklayarak verileri kaydetmek.
Not: agregasyon hızının hesaplanması yüzdesi olarak kümelenme işlemi uç sonuçlar ifade bilgisayar tarafından gerçekleştirilir. - Verileri analiz edin.
- Yıkanmış trombositler süspansiyonlar ve trombosit agregasyonunun türbidimetrik ölçüm hazırlanması için protokoller ek detaylı bilgi için bu alanda 12, 13, uzmanlar tarafından kaleme diğer kağıtlar bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
agregasyonu yazılım otomatik agregasyon eğri oluşturur ve yüzde olarak maksimum agregasyon değerlerini vermektedir. değerleri istatistiksel analiz ve çubuk grafikler halinde maksimum toplanma değerleri görselleştirmek için bir veri analiz yazılımı kopyalanabilir. İsteğe bağlı olarak, toplama eğrileri her bir nokta eğrileri görselleştirmek için bir tablo yazılımı içine ve daha sonra istatistiksel yazılım (örneğin, GraphPad) art arda verilebilir. Bazı araştırmacılar, trombosit etkinliğini değerlendirmek için eğrinin altındaki hız ve alanını hesaplamak için agregasyon eğrisinin maksimum eğim kullanımı. gecikme süresi ve şekli değişiklik aynı zamanda grafiksel görüntülenebilir.
Kontrol koşulları altında Yıkanmış insan trombositleri (H2O) bir agregasyon eğrisinin tipik bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. a eklenmesi(Kısa bir süreden sonra) ile indüklenen gonist (kolajen), platelet şekil değişimi neden agregasyon eğrisinin bir depresyon. Daha sonra, yavaş yavaş bir maksimum değer kadar zamanla artmış, agregasyon yüzdesi yaklaşık 3-4 dakika ulaşılmıştır. agregasyon yüzdesi hafif bir azalma bazı ayrılmasını yansıtır 6 dakika kayıt, sonuna doğru görüldü. Şekil 2A-B'de görüldüğü gibi, ön enkübasyona tabi tutulması insan Panx1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile yıkanmış plateletler, 1 mM'lik bir konsantrasyonda, yavaşlamış ya da tamamen başlangıç trombosit şekil değişikliği kaldırılmış ve 5 ile elde edilen yıkanmış trombosit kollajen indüklü bir araya gelme bloke farklı ilgisiz sağlıklı gönüllüler. Parlak Mavi FCF düşük bir konsantrasyonda (100 uM) ile ön inkübasyona tabi trombositler, kolajen ile uyarılan yanıtlar ve şekil değişikliği boya inhibitör etkisi artık gözlenmemiştir zaman (örnek için Şekil 2A 'ya bakınız). Quantif1 ug / ml kolajen ile uyarılan platelet toplanması tepkilerini önemli ication Kontrol koşulları ve aynı zamanda Panx1 inhibitörünün düşük bir konsantrasyonda (100 uM) (Şekil 2C) ile karşılaştırıldığında, 1 mM Parlak Mavi FCF önemli ölçüde maksimum toplanma tepkileri azalttığını ortaya koymuştur. Trombosit agregasyonu inhibisyonu ile indüklenen agregasyon yanıtı etkilemedi boyanın aynı konsantrasyonda (1 mM) ve (örneğin, hücre canlılığı ile ilgili) Brillant Blue FCF istenmeyen yan etkileri nedeniyle, kolajen ile uyarılan yanıtlar için spesifik ve değildi Şekil 2D'de gösterildiği gibi, bir agonist, 75 uM AA yani. Bu sonuçlar, ve diğerleri, daha önce, örneğin probenesid, meflokin olarak Panx1 diğer farmakolojik inhibitörlerinin göstermiştir insan trombositleri kolajen ile uyarılan agregasyon yanıtlarında Panx1 özel kanal rolünü teyit ve spesifik bağlanma 10 Panx1 peptidler 7, 8.
Şekil 1: agregometri. Agregometri için kullanılan (A) (bir karıştırma mıknatıs içeren) cam küvetler temsili görüntüsü. Sağdaki küvet kolajen ile uyarılan aktivasyon sonrası trombosit agrega göstermektedir Soldaki küvet dinlenme trombositler gösterir. (B), türbidimetrik ölçümleri için bir 8-agregometrenin bir Örnek görüntüsü. Kuyular, 37 ° C'de bir cam küvet içinde mevcut trombosit süspansiyonlar inkübasyona (yıldız) kullanılabilir ve ölçümleri (beyaz ok) için kullanılan C. gösterilir , bu şekil büyük halini görüntülemek için tıklayın.
Şekil 2: Kolajen yanıt olarak, Brilliant Blue FCF Bloklar platelet aktivasyonu yüksek bir konsantrasyon. (A), insan kolajen kaynaklı agregasyonun Örnek izleri yıkanıp kontrol koşulları altında aynı sağlıklı gönüllü (V1) 'den elde edilmiş plakalar (H2O; koyu mavi) ya da 1 mM'de Panx1 inhibitörü Parlak Mavi FCF 7 dakika ön inkübasyondan sonra ( açık mavi) ya da 100 uM'de (ara mavi renk). Toplama kalıntıları 6 dakika boyunca kaydedildi. (B) insan kolajen kaynaklı agregasyonun Örnek izleri yıkanıp Panx1 inhibitörü Parlak Mavi FCF (1 mM) ile 7 dakika ön inkübasyondan sonra 4 sağlıklı gönüllü (V2-V5) elde edilen platelet gibi olabilir. Insan maksimum toplanma tepkileri (C) miktarının belirlenmesi kontrol koşullarında (beyaz çubuk) altında ya da 100 uM (gri bar) Brillant Blue FCF 7 dakika ön inkübasyondan sonra ya da 1 mM (siyah çubuk) ile yıkanmış plateletler. N = 5. **** P0 0.0001; ANOVA çoklu karşılaştırma için Bonferroni post-testi ile takip; Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. (D) insan AA kaynaklı agregasyonun Örnek izleri yıkanıp Panx1 inhibitörü Parlak Mavi FCF (1 mM) ile 7 dakika ön inkübasyondan sonra 5 sağlıklı gönüllü (V1-V5) elde edilen platelet gibi olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanama riskini artıran olmadan tromboz önlemek amacıyla trombosit fonksiyonunu modüle edebilen yeni ilaç bulmakta büyük bir ilgi vardır. Bu amaç için, güvenilir ve tekrarlanabilir bir insan plateletlerinde agregasyon karşılıklarının izlenmesi için, in vitro laboratuar testleri kesinlikle gereklidir. Bulanıklık agregometri gerçekleştirmek için kolay bir tekniktir. Ancak, bazı önlemler unutulmaması gerekir. toplama işlemi karıştırıldıktan büyük ölçüde bağımlı olduğu gibi ölçümler sürekli karıştırma altında gerçekleştirilmesi gerekir. Erken aktivasyon her tür önlemek için, 37 ° C'lik bir fizyolojik sıcaklıkta trombositler tutmak için de önemlidir. trombosit önceden etkinleştirilmesi, aynı zamanda, kan toplama sırasında meydana gelen ve doğal agregasyonuna yol açan, trombositler hazırlık yıkandı olabilir. Böylece dikkatli önlemler trombosit hazırlama tam prosedür sırasında alınmalıdır.
Türbidimetrik O dayanırn, trombosit süspansiyonu OD ölçümü. Bu, kırmızı kan hücreleri için tüm kan toplanma ölçümü için uygun bir teknik yapar. Bu nedenle, türbidimetri sadece PRP veya PRP izole yıkanmış trombositler üzerinde gerçekleştirilebilir. Kolay başa ve oldukça ucuz olsa da, türbidimetri mikroagregatlar 14, 15 varlığına duyarsız olarak kabul edilmiştir. Mikroagregat kritik öneme sahip olduğu beklendiği durumlarda, trombositler sitratlı bütün kan numunesi içine daldırılmış bir elektrota bağlı oluşan elektrik direncindeki değişimi ölçen empedans aggregometri, 16 daha uygundur. Platelet agregasyon işlemi ayrıca trombosit süspansiyonu 17 trombosit sayısı büyük ölçüde bağlıdır; akım sitometri, trombositopeni 18 muzdarip hastalarda kullanılır kimden trombosit sayısı oelde edilebilir bulanıklık için yetersizdir. Bununla birlikte, bulanıklık genel avantajı, bu tür tam kan örnekleri içinde değerlendirilemeyen şekil değişikliği ve ayrıştırma gibi, trombosit reaktivitesi ayrıntılı bir analizini sağlar olmasıdır.
İnsan Platelet toplanmasının doğal varyasyon nedeniyle yaş, cinsiyet ve yaşam tarzı hem de trombosit fonksiyonu meydan 19, 20, 21 öznenin sağlık durumunda farklılıklara varolduğunu fark etmek önemlidir. güvenilir istatistik izin vermek için akraba olmayan sağlıklı gönüllülerin yeterli sayıda gelen tabakalar elde etmek için, performans ve bu deneyler yorumlanırken gibi doğal varyasyon, bu şekilde bakım alınmalıdır türbidimetrik sonuçlar% 10-20 mertebesinde olabilir. Bu sınırlama, ancak türbidimetrik ölçümler, en azından zaman agregasyon yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu gerçeği ile dengelenmektedirprosedürler de laboratuvarlar boyunca standardize edilmiştir. Standardizasyon çalışmaları inhibitörü bulunmaktadır 22 Uluslararası Derneği tarafından yapılmıştır. Bu nedenle, türbidimetri hala hem klinik hem de temel bilim laboratuvarlarında trombosit toplanmasının ölçümü için en sık karşılaşılan testtir ve trombosit yanıtları ilaçların etkisini incelemek için seçtikleri bir tekniği kalır.
Bu çalışmada, bir yaygın olarak kullanılan gıda boyası Parlak Mavi FCF, trombosit agregasyonunu etkiler, insan yıkandı trombositlerde tepkilerini ölçmek için türbidimetri kullanarak göstermiştir. Yakın elektrofizyolojik çalışmalar bu boya 9, 23 tarafından Panx1 kanallarının spesifik blokajı ortaya çıkarmıştır. Gerçekten de, bu boyanın yüksek konsantrasyonlarda (1 mM), kolajen ile uyarılan şekil değişikliği ve maksimal toplama ancak daha düşük konsantrasyonlar 10 kat, her iki ilgili önleyici etkilerini göstermiştir (100 uM)Boyanın platelet agregasyon yanıtı etkilemedi. Avrupa Gıda Güvenliği Kurumu 24 tarafından yayınlanan bir gıda katkı maddesi olarak, Brilliant Blue FCF (E133) yeniden değerlendirilmesi Bilimsel Görüş göre, Parlak Mavi FCF (molekül ağırlığı = 792,84 g / mol) maksimal izin verilen konsantrasyonu 500 gıda mg / kg'dir. H2O, bu deneylerde kolajen ile uyarılan platelet birikmesini inhibe bir daha 1.59-kat daha düşük konsantrasyonu 0.63 mM, karşılık gelir. boyanın sadece küçük bir bölümü, oral sindirimden sonra bağırsak içinde emilecek olduğu varsayılarak, boya son olarak bir yetişkin bir kişinin kan 5-L hacmi içinde seyreltilmiştir edecektir ki bu mavi gıda boyası günlük alım muhtemelen var trombosit agregasyonu üzerinde, herhangi bir yan etki beklenebilir önce büyük ölçüde normal seviyelere aşması. trombosit canlılığı üzerindeki deneylerde, boyanın yüksek konsantrasyon olası yan etkileri, örneğin vardıBaşka bir agonist (AA) bir katı kümelenme yanıtlarının varlığı söz konusu olmamaktadır. Bu etkilenmemiş AA tepkileri de Parlak Mavi FCF önleyici etkileri, özellikle kolajen sinyal yolunu içerir görünmektedir doğruladı. Bu hat içi kolajen ile uyarılan platelet agregasyonu yanıt olarak Panx1 kanallardan ATP serbest bırakılması için özel bir yer ayrıntılı daha önceki çalışmada 7 ile.
Bu çalışma için yıkanmış trombosit izolasyon protokolü adapte olarak, insan kanından trombositleri izole etmek için basit ve kolay bir yöntem açıklanmaktadır. birkaç yıkama adımları santrifüj ile esas olarak gerçekleştirilen sonra, trombositler de dahil olmak üzere pH kesin fizyolojik koşulları, çalışma sıcaklığı ve çift değerli iyonların konsantrasyonu saygı ancak plazma proteinlerinin olmadığını garanti bir ortam içinde yeniden süspanse edilir. Bu jel filtrasyonu gibi bilinen alternatif yöntemlerin üzerinde bu tekniğin bir avantajı, plazma compon olan eleme içindeveliler 25 oluşmaz.
Yıkama işleminin tüm adımları yıkanmış plateletler kullanıldığında yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için büyük önem taşımaktadır. İlaçların bir bolluk böylece sağlıklı gönüllüler kan toplama öncesinde en az 10 gün boyunca herhangi bir ilaç almayan istenir esastır, trombosit reaktivitesi etkileyebilir. Buna ek olarak, kan toplama bu trombin ve sonraki trombosit aktivasyonu 22 üretimini neden olabileceğinden dikkat ven travma veya çok yavaş akışını önlemek için ödenir gerektirmektedir. Aynı doğrultuda, santrifüjleme ve yıkama adımları sırasında potansiyel trombosit aktivasyonu PGI2 tekrar tekrar kullanımı ile önlenebilir. Çok düşük kararlılık nedeniyle, PGI2 her santrifüj hemen önce her bir yıkama aşamasında ilave edilmelidir. apiraz içeren (bir fizyolojik pH değerinde) ta tamponu içinde yeniden süspansiyon haline trombositlerin trombosit tepkileri kalmasını sağlarbozulmamış. trombosit süspansiyonu içinde apiraz bulunması, purinerjik reseptörlerin duyarsızlaştırmadan trombositler korumak için ATP ve ADP ayrıştırılmasını sağlamaya esastır. Sinyal yolunun Panx1 kolajen reseptör aktivasyonu üzerine insan plateletlerinde P2X1 reseptör aktivasyonunu kapsar olarak, P2X1 duyarsızlaştırma 7 önlemek için trombosit süspansiyona apiraz arasında nispeten yüksek bir konsantrasyonda (0.32 U / ml) ilave edildi. Trombosit diğer purinerjik reseptörlerin densensitization önlemek için, apiraz düşük konsantrasyonlarda 10 yeterli olacaktır.
Seri santrifüj ve yıkama adımları prosedürü emek yoğun ve daha fazla zaman gerektirir, ancak yıkanmış trombositler Bu protokol kullanılarak (PRP doğrudan kullanılabilir trombositler kıyasla 1 37 ° C (5-8 saat) daha yüksek bir kararlılık yararı teklif edilen -3 saat). Ancak, TZP kullanarak seçimi veya yıkanmış trombosit yapılmalıdır cautiously ve deney için uygun kan miktarı gibi faktörleri içerir gerekir agonist ele alınacaktır söz hem de kullanılır. Örneğin, aktif α2β3 integrinlerinin fibrinojenin bağlanmasının platelet agregasyonunu, reaksiyon etkileyebilecek yıkanmış trombosit fibrinojen yokluğunun neden olan ana mekanizmadır; Özellikle, (ADP) zayıf agonistleri 13 kullanıldığı zaman. Bu sorun, güçlü bir agonisti örneğin tek başlarına α-granüllerden fibrinojen salınmasını uyarabilen trombin veya kolajen gibi kullanıldığı zaman, daha az kritiktir. Yine de, rutin Kollajen ile indüklenen agregasyon cevabın çokluğunu arttırmak amacıyla, yıkanmış insan trombositi süspansiyonuna eksojen fibrinojen ekleyin.
Sonuç olarak, insan kullanılarak yıkanmış plateletler ve türbidimetri, gıda boyası Parlak Mavi FCF, Panx1 üzerindeki inhibe edici etkisi ile, temsil ettiği bulundutrombosit fonksiyonunun potansiyel bir önleyicisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (Pierre Fontana 310030_162579 / Brenda Renata Kwak 1 ve 320030_144150) yanı sıra ile İsviçre Kalp Vakfı bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
