Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie
Summary
We beschrijven een eenvoudige methode voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door agonist-geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes metingen door turbidimetrie. Als voorbeeld passen we deze methode voor het bestuderen van aggregatie van humane bloedplaatjes aan collageen na voorincubatie met Pannexin1 kanaal remmer Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetrie is een laboratorium techniek die wordt toegepast op de aggregatie van bloedplaatjes gesuspendeerd in hetzij plasma (bloedplaatjes-rijk plasma, PRP) of in buffer (gewassen bloedplaatjes) meten met behulp van een of een combinatie van agonisten. Het gebruik van gewassen bloedplaatjes gescheiden van hun plasma omgeving en in de afwezigheid van anticoagulantia zorgt voor het bestuderen van de intrinsieke bloedplaatjes eigenschappen. Onder het grote paneel agonisten, arachidonzuur (AA), adenosine di fosfaat (ADP), trombine en collageen zijn de meest gebruikte. De aggregatie respons wordt gekwantificeerd door meting van de relatieve optische dichtheid (OD) in de tijd van bloedplaatjes suspensie onder voortdurend roeren. Bloedplaatjes in homogene suspensie beperking van de doorgang van licht na de toevoeging van een agonist, treedt bloedplaatjes vormverandering produceren een kleine tijdelijke stijging van OD. Na deze eerste activeringsstap bloedplaatjes stolsels vormen geleidelijk, waardoor de doorgang van licht door de suspensie als een result verminderde OD. De aggregatie uiteindelijk uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de OD van bloedplaatjes-arm plasma of buffer. Strenge kalibratie is dus essentieel bij het begin van elk experiment. In het algemeen: 0% kalibratie wordt door meting van de OD van niet-gestimuleerde bloedplaatjes suspensie tijdens het meten van de OD van het suspensiemedium dat geen bloedplaatjes een waarde van 100% ingesteld. Plaatjesaggregatie wordt meestal voorgesteld als een real-time aggregatie curve. Turbidimetrie is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor het onderzoek van de bloedplaatjes functie en wordt beschouwd als de historische gouden standaard en gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische middelen die gericht zijn op het remmen van de aggregatie van bloedplaatjes. We beschrijven gedetailleerde protocollen 1) Bereiding van humane plaatjes gewassen en 2) turbidimetrische analyse van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke bloedplaatjes gewassen voorbehandeld met de voedselkleurstof Brilliant Blue FCF die onlangs identiteit wastificeerd als een remmer van Pannexin1 (Panx1) kanalen.
Introduction
Bloedplaatjes zijn essentiële bestanddelen van het bloed en hun belangrijkste functie-met-stollingsfactoren te stoppen met bloeden na bloedvat letsel. Bloedplaatjes zijn kleine (2-3 um) kernloze fragmenten verkregen van megakaryocyten van het beenmerg 1. Trombocyten circuleren in niet-geactiveerde toestand, waarbij ze als lensvormig structuren. Bij onderbreking van het endotheel, bloedplaatjes verzamelen op de site van bloedvat letsel aan het gat, een proces genaamd primaire hemostase plug. Aanvankelijk bloedplaatjes hechten aan sub-endotheliale moleculen zoals collageen en von Willebrand factor, die blootgesteld zijn als gevolg van de schade-adhesie stap 2. Vervolgens zij vorm veranderen en uitscheiden chemische boodschappers-activeringsstap. Tot slot hebben ze met elkaar te verbinden door het overbruggen van receptoren-aggregatie stap. Primaire hemostase wordt gevolgd door een secundair proces waarbij activering van de stollingscascade met fibrine depositie, welke stabiliserenTussen de eerste trombus 2.
Acute ischemische gebeurtenissen zoals myocardinfarct 3 meestal het gevolg van trombi die worden gevormd door fysische verstoring (breuk) van een atherosclerotische plaque. Huidige anti-bloedplaatjes geneesmiddelen zijn de hoeksteen van de behandeling van deze wijdverspreide ziekte, maar hun klinisch voordeel wordt beperkt door een verhoogd risico op bloedingen. De meest voorgeschreven medicijnen cardiovasculaire patiënten, aspirine en anti-P2Y12 verbindingen, richten de tromboxaan A2 en ADP paden 4 getoond, die de belangrijkste routes die tot bloedplaatjes activering. Echter, innovatief onderzoek naar nieuwe targets die optimaal antitrombotische effecten en hemorragische risico zou in evenwicht te brengen is nog steeds noodzakelijk.
Vanaf de jaren 1960 5 tot vandaag, heeft turbidimetrische aggregometrie een cruciale rol in het onderzoek gespeeld, het verbeteren van onze kennis van bloedplaatjes reactiviteit en in de monitoring van de potentie van anti-trombotische reagentia bij de mens. Turbidimetrie werd aanvankelijk toegevoerd aan PRP geëxtraheerd uit bloedmonsters. Inderdaad, bloedafname uitgevoerd in buisjes die citraat maakt een snelle en grote productie van PRP zonder enig effect op bloedplaatjes integriteit en functie. De stabiliteit op korte termijn (ongeveer 3 h) van PRP en de resterende plasmatische enzymen, zoals trombine, en de lage calciumconcentratie in verband met mogelijk artefact aggregatie profielen van groot ongemak voor de toepassing van PRP. Een belangrijke stap voorwaarts is de ontwikkeling van een methode voor bloedplaatjes isoleren met extra centrifugeren en wassen stappen 6 geweest. Kortom, PRP geïsoleerd uit volbloed on zuur-citraat-dextrose (ACD) en bloedplaatjes worden geïsoleerd na seriële centrifugatiestappen alvorens opnieuw gesuspendeerd in een iso-osmotische fosfaatbuffer (Tyrode's buffer) bevattende glucose, humaan serumalbumine en tweewaardige caties (Ca 2+ en Mg 2+). Om veranderingen in de bloedplaatjes reactiviteit te vermijden, wordt de pH van buffer Tyrode zorgvuldig bewaard bij 7,35-7,4. Bovendien wordt ongewenste activering van bloedplaatjes voorkomen door toevoeging van prostacycline (PGI2) vóór sommige centrifugatiestappen. Tenslotte toevoeging van apyrase gewassen plaatjes verhindert van resistent tegen de werking van ATP / ADP. De verkregen suspensie van bloedplaatjes mist coagulant factoren en de stabiliteit van bloedplaatjes met ten minste twee maal in vergelijking met PRP oplossingen. Bovendien, het feit dat bloedplaatjes inactief maar intact garandeert de reproduceerbaarheid van turbidimetrische metingen en biedt de mogelijkheid om de werking van agonisten of antagonisten van bloedplaatjesaggregatie optimaal bestuderen.
Met deze methode, hebben we in een recent onderzoek dat remmen van de vorming van Panx1 kanalen van een genetische benadering (knock-out-muizen) of verlagen Panx1 kanaalactiviteit met farmacologischebenaderingen verlaagde collageen-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie 7. Panx1 vormt ATP-afgifte kanalen, die alom tot expressie worden gebracht op vele celtypen waaronder menselijke bloedplaatjes 7, 8. In feite hebben we gedemonstreerd door turbidimetrie menselijke gewassen bloedplaatjes dat een 7 min voorincubatie met een panel van meer of minder specifieke chemische blokkers (probenecide, mefloquine en 10 Panx1 peptiden) voor de toevoeging van verschillende agonisten, remde het bijzonder collageen geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes terwijl bloedplaatjes reacties op AA en ADP niet werden getroffen. We hebben aangetoond dat ATP de afvoer via Panx1 kanalen specifiek ingrijpt in de GPVI signaleringsroute die leidt tot collageen-geïnduceerde aggregatie. Interessant meerdere FDA goedgekeurde verbindingen met toepassingen in andere ziekten (probenecid, mefloquine) invloed op de activiteit van Panx1 kanalen in bloedplaatjes. Aan de ene kant is dit opent nieuwe therapeutische perspectieven te selecterenively wijzigen bloedplaatjes reactiviteit. Aan de andere kant moet men mogelijke secundaire effecten van deze verbindingen te overwegen. In dit verband heeft de veilige voedselkleurstof Brilliant Blue FCF gebruikt op diverse snoep en energiedranken is beschreven als een selectieve remmer van Panx1 9. We beschrijven hier een protocol voor de isolatie van menselijke gewassen bloedplaatjes en turbidimetrische metingen van bloedplaatjesaggregatie ingericht om het effect van Brilliant Blue FCF kleurstof als een antagonist van plaatjesaggregatie onderzocht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is veel belangstelling voor het vinden van nieuwe geneesmiddelen in staat tot het moduleren van de functie van bloedplaatjes om trombose te voorkomen, zonder het verhogen van het risico van bloeden. Hiertoe kunnen in vitro laboratoriumtests die betrouwbaar en reproduceerbaar kunnen controleren aggregatie reacties bij menselijke bloedplaatjes absoluut noodzakelijk. Turbidimetrische aggregometrie is een eenvoudige techniek uit te voeren. Echter, moet een aantal voorzorgsmaatregelen in acht te worden gehouden. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (310030_162579 / 1 tot Brenda Renata Kwak en 320030_144150 Pierre Fontana), alsmede door een subsidie van de Zwitserse Hartstichting.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
