Турбидиметрия на человеке промытых тромбоциты: Влияние Pannexin1-ингибитор Brilliant Blue FCF на индуцированный коллаген агрегации
Summary
Мы опишем простой способ выделения промытых тромбоцитов из человеческой крови с последующим агонист-индуцированной агрегацией тромбоцитов измерений по турбидиметрии. В качестве примера можно применить этот метод для изучения реакции агрегации тромбоцитов человека к коллагену после предварительной инкубации с ингибитором канала Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Abstract
Турбидиметрия является лабораторная методика, которая применяется для измерения агрегацию тромбоцитов, взвешенных в плазме (либо обогащенной тромбоцитами плазмы, PRP) или в буфере (промытых тромбоцитов), с использованием одного или комбинации агонистов. Использование промытых тромбоцитов, выделенные из плазмы их среды и в отсутствии антикоагулянтов позволяет изучать внутренние свойства тромбоцитов. Среди большой панели агонистов, арахидоновых кислот (АА), аденозин-ди-фосфат (АДФ), тромбин и коллаген является наиболее часто используемым. Реакция агрегации количественно путем измерения относительной оптической плотности (OD) с течением времени суспензии тромбоцитов при непрерывном перемешивании. Тромбоциты в гомогенной суспензии ограничивают прохождение света после добавления агониста, тромбоциты происходит изменение формы производить небольшое преходящее увеличение OD. После этой начальной стадии активации, тромбоциты сгустки образуют постепенно, позволяя прохождение света через суспензию в качестве Резаии уменьшенного OD. Процесс агрегации, в конечном счете, выраженное в процентах, по сравнению с наружным диаметром обедненной тромбоцитами плазмы или буфера. Строгие калибровки Таким образом, важны в начале каждого эксперимента. Как общее правило: калибровка до 0% устанавливается путем измерения ОП не-стимулированных суспензии тромбоцитов при измерении оптической плотности суспензии среде, не содержащей тромбоциты представляет значение 100%. агрегации тромбоцитов, как правило, визуализируются в виде кривой агрегации в режиме реального времени. Турбидиметрия является одним из наиболее часто используемых лабораторных методов для исследования функции тромбоцитов и рассматриваются как исторический золотой стандарт и используются для разработки новых фармацевтических средств, направленных на ингибировании агрегации тромбоцитов. Здесь мы описываем подробные протоколы для 1) подготовки человека промывают тромбоциты и 2) турбидиметрический анализ индуцированного коллагена агрегации тромбоцитов человека промытого предварительно обработанные с пищевым красителем Brilliant Blue FCF, который был недавно IDENtified в качестве ингибитора (Panx1) каналов Pannexin1.
Introduction
Тромбоциты являются важнейшими компонентами крови и их основной функции тусовки с коагуляцией факторами, чтобы остановить кровотечение после травмы кровеносных сосудов. Тромбоциты представляют собой небольшие фрагменты (2-3 мкм) безьядерные , полученные из мегакариоцитов костного мозга 1. Тромбоциты циркулируют в неактивированном состоянии, в течение которого они появляются в виде линзовидных структур. После перерыва в эндотелии, тромбоциты собираются в месте повреждения кровеносного сосуда, чтобы заткнуть дыру, процесс, называемый первичный гемостаз. Первоначально, тромбоциты прикрепляются к югу от эндотелиальной молекул, таких как коллаген и фактор фон Виллебранда, которые подвергаются воздействию в результате стадии травмы адгезии 2. Затем, они изменяют форму и секретируют химический шаг мессенджеры-активации. И, наконец, они соединяются друг с другом, соединяя шаг рецепторы-агрегации. Первичный гемостаз с последующим вторичным способом, включающим активацию каскада свертывания с отложением фибрина, которые стабилизируютев первоначальный тромб 2.
Острые ишемические события , такие как инфаркт миокард-часто является результат тромбов , которые формируют из – за физическое разрушение (разрыв) атеросклеротической бляшки. Современные антитромбоцитарные препараты являются краеугольным камнем лечения этого распространенного заболевания, но их клиническая эффективность ограничена повышенным риском кровотечения. Наиболее предписанные лекарства в сердечно – сосудистых больных, аспирин и анти-P2Y12 соединений, целевой тромбоксана А2 и ADP пути 4, соответственно, которые являются основными пути , ведущие к активации тромбоцитов. Тем не менее, инновационные исследования к новым целям, которые будут оптимально сбалансировать антитромботические эффекты и haemorragic риск по-прежнему необходимо.
С 1960 – х лет 5 до сегодняшнего дня, Турбидиметрическая агрегометрия играет важную роль в исследованиях, повышение наших знаний о реактивности тромбоцитов и яп мониторинг активности антитромботических реагентов в организме человека. Турбидиметрия был первоначально применен к PRP, извлеченной из образцов крови. В самом деле, сбор крови проводили в пробирки, содержащие цитрат позволяет быстро и большое производство PRP без какого-либо влияния на целостность тромбоцитов и функции. Тем не менее, кратковременная стабильность (около 3 ч) ПОТА, а остальные плазматических ферменты, таких как тромбин, и низкая концентрация кальция, связанная с потенциально артефактным профилей агрегации имеют большое неудобство для использования PRP. Важный шаг вперед стал разработкой методы для выделения тромбоцитов с дополнительным центрифугированием и промывкой шаги 6. Короче говоря, ПРП выделяют из цельной крови, собранной на кислотно-цитрат-декстроза (ACD) и тромбоциты выдел ют после стадий последовательного центрифугирования перед тем, как снова суспендируют в изо-осмотического фосфатного буфера (буфера Тирода), содержащей глюкозу, сывороточный альбумин человека и двухвалентной сations (Ca 2+ и Mg 2+). Для того, чтобы избежать изменений в реактивности тромбоцитов, рН буфера Тироды тщательно хранятся в 7.35-7.4. Кроме того, нежелательная активация тромбоцитов предотвращаются путем добавления простациклина (PGI 2) , прежде чем несколько шагов центрифугирования. Наконец, добавление апиразы предотвращает промытые тромбоциты стать устойчивыми к действию АТФ / АДФ. Полученную суспензию тромбоцитов не хватает коагулянта факторов и стабильность тромбоцитов увеличивается, по меньшей мере, в два раза по сравнению с PRP решений. Кроме того, тот факт, что тромбоциты являются неактивными, но интактным гарантирует, что воспроизводимость измерений турбидиметрических и обеспечивает возможность изучить действие агонистов или антагонистов агрегации тромбоцитов оптимальным образа.
С помощью этого метода, мы показали в недавнем исследовании, что ингибирования образования Panx1 каналов с помощью генетического подхода (нокаут-мыши) или уменьшение активности канала Panx1 фармакологическогоподходы уменьшенных индуцированного коллагена агрегации тромбоцитов 7. Panx1 формирует АТФ-релиз каналы, которые экспрессируются во многих типах клеток , в том числе тромбоцитов человека 7, 8. На самом деле, мы продемонстрировали турбидиметрии на человеческом промывают тромбоциты , что 7 мин инкубация с группой более или менее специфических химических блокаторов (пробенецид, мефлокина и 10 Panx1 пептидов) перед добавлением различных агонистов, ингибирует специфический коллаген-индуцированная агрегации тромбоцитов, а тромбоциты ответы на АА и АДФ не были затронуты. Мы показали, что высвобождение АТФ через Panx1 каналы специфически вмешивается в сигнальной GPVI пути, ведущего к индуцированной коллагеном агрегации. Интересно, что несколько FDA утвержденного соединения с приложениями в других заболеваниях (пробенецид, мефлокина) влияет на активности Panx1 каналов в тромбоцитах. С одной стороны, это открывает новые терапевтические перспективы для выбораively изменение реактивности тромбоцитов. С другой стороны, следует учитывать возможные побочные эффекты этих соединений. В этом контексте, безопасный пищевой краситель Brilliant Blue FCF используется в нескольких конфетами и энергетических напитков был описан как селективный ингибитор Panx1 9. Здесь мы опишем протокол для выделения человеческих тромбоцитов и промывают турбидиметрическое измерение агрегации тромбоцитов адаптированы для исследования влияния Brilliant Голубого красителя FCF в качестве антагониста агрегации тромбоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует большой интерес к поиску новых препаратов, способных модулировать функцию тромбоцитов, чтобы предотвратить тромбоз не увеличивая риск кровотечения. Для этой цели в пробирке лабораторные тесты , которые могут надежно и воспроизводимо контролировать реакцию агрегации …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Швейцарского Национального научного фонда (310030_162579 / 1 к Бренда Рената Квак и 320030_144150 Пирр Фонтана), а также за счет гранта Швейцарского фонда сердца.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
