Turbidimetri på Human Tvättade Trombocyter: Effekten av Pannexin1-hämmaren Brilliant Blue FCF på Kollageninducerad Aggregation
Summary
Vi beskriver en enkel metod för isolering av tvättade blodplättar från humant blod följt av agonist-framkallad blodplättsaggregation mätningar genom turbidimetri. Som ett exempel vi tillämpa denna metod för att studera aggregeringen svaret hos humana blodplättar till kollagen efter en förinkubation med Pannexin1 kanalhämmare Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri är en laboratorieteknik, som appliceras för att mäta aggregation av blodplättar suspenderade i antingen plasma (blodplättsrik plasma, PRP) eller i buffert (tvättade trombocyter), genom användning av en eller en kombination av agonister. Användningen av tvättade blodplättar separerade från sin plasma miljö och i frånvaro av antikoagulanter gör för att studera inneboende egenskaper trombocyter. Bland det stora panel av agonister, arakidonsyra (AA), adenosin di-fosfat (ADP), trombin och kollagen är den mest använda. Aggregationen svar kvantifieras genom mätning av den relativa optiska densiteten (OD) över tiden av blodplättssuspension under kontinuerlig omröring. Trombocyter i homogen suspension begränsa passagen av ljus efter tillsats av en agonist, inträffar blodplättsformförändring producerar en liten övergående ökning av OD. Efter denna första aktiveringssteg, blodplättsproppar bildar gradvis, vilket tillåter passagen av ljus genom suspensionen som en result av minskade OD. Aggregationsprocessen slutligen uttryckt i procent, jämfört med OD av blodplättsfattig plasma eller buffert. Rigorös kalibrering är därför viktigt i början av varje experiment. Som en allmän regel: kalibrering till 0% ställs in genom att mäta OD av en blodplättssuspension icke-stimulerade under mätning av OD av suspensionsmedium innehållande inga trombocyter representerar ett värde på 100%. Trombocytaggregation allmänhet visualiseras som en realtids-aggregering kurvan. Turbidimetri är en av de vanligaste laboratorietekniker för undersökning av blodplättfunktionen och anses vara den historiska guldstandard och används för att utveckla nya läkemedel för att hämma trombocytaggregation. Här beskriver vi detaljerade protokoll för en) beredning av humant tvättade blodplättar och 2) turbidimetrisk analys av kollagen-inducerad aggregation av humana tvättade blodplättar som förbehandlats med maten färgämnet Brilliant Blue FCF som var nyligen identified som en hämmare av Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Trombocyter är avgörande komponenter i blodet och deras huvudsakliga funktions tillsammans med koagulationsfaktorer-is för att stoppa blödning efter blodkärlsskada. Trombocyter är små (2-3 um) anuclear fragment härledda från megakaryocyter i benmärgen 1. Trombocyter cirkulera i icke-aktiverat tillstånd, under vilket de uppträder som linsformade strukturer. Vid avbrott i endotel, trombocyter samlas till platsen för blodkärlsskada att plugga hålet, en process som kallas primär hemostas. Initialt, blodplättar fäster vid sub-endoteliala molekyler, såsom kollagen och von Willebrand-faktor, som är exponerade som ett resultat av skadan-vidhäftningssteget 2. Sedan de ändra form och utsöndrar kemiska budbärare-aktiveringssteg. Slutligen de ansluter till varandra genom att överbrygga receptorer-aggregering steg. Primär hemostas följs av en sekundär process som involverar aktivering av koagulationskaskaden med fibrinavsättning, som stabiliserars det initiala tromben 2.
Akuta ischemiska händelser såsom hjärtinfarkt 3 beror ofta på tromber som bildar grund av fysiska avbrott (brott) av ett aterosklerotiskt plack. Nuvarande trombocythämmande läkemedel är hörnstenen i behandlingen av denna folksjukdom men deras kliniska nyttan är begränsad av en ökad risk för blödning. De mest förskrivna läkemedlen i kardiovaskulära patienter, aspirin och anti-P2Y12 föreningar, rikta tromboxan A2 och de ADP banorna 4, respektive, vilka är de huvudsakliga vägar som leder till blodplättsaktivering. Det är dock fortfarande nödvändigt innovativ forskning mot nya mål som optimalt skulle balansera antitrombotiska effekter och hemorragisk risk.
Från 1960-talet 5 till idag, har turbidimetrisk aggregometri spelat en avgörande roll inom forskning, öka vår kunskap om trombocytreaktivitet och jagn övervakning av styrkan av antitrombotiska reagens i människor. Turbidimetri applicerades initialt till PRP extraherades från blodprover. Indeed, bloduppsamling utfördes i rör innehållande citrat möjliggör snabb och stor produktion av PRP utan att ha någon effekt på blodplätts integritet och funktion. Emellertid, den kortsiktiga stabilitet (ca 3 h) hos PRP och de återstående plasmatiska enzymer, såsom trombin, och kalciumkoncentrationen låg förknippas med potentiellt artefactual aggregering profiler av stora olägenheter för användningen av PRP. Ett viktigt steg framåt har varit utvecklingen av en metod för isolering av blodplättar med ytterligare centrifugering och tvätt steg 6. Kort sagt, är PRP isolerades från helblod uppsamlades på syra-citrat-dextros (ACD) och blodplättar isolerades efter seriell centrifugeringssteg innan de återsuspenderades i en iso-osmotisk fosfatbuffert (Tyrodes buffert) innehållande glukos, humant serumalbumin och tvåvärd cations (Ca2 + och Mg2 +). För att undvika förändringar i trombocytreaktivitet pH av Tyrodes buffert noggrant hålls på 7,35-7,4. Dessutom är oönskad aktivering av trombocyter förhindras genom tillsats av prostacyklin (PGI 2) innan några centrifugeringssteg. Slutligen tillsats av apyras förhindrar tvättade blodplättar från att bli resistent mot verkan av ATP / ADP. Den resulterande blodplättssuspension saknar koagulerande faktorer och stabiliteten av blodplättar ökar med åtminstone två-faldigt jämfört med PRP-lösningar. Dessutom det faktum att blodplättar är inaktiva men intakta optioner reproducerbarheten av turbidimetriska mätningar och ger förmågan att studera verkan av agonister eller antagonister av blodplättsaggregation på ett optimalt sätt.
Användning av denna metod har vi visat i en färsk studie att inhibera bildningen av Panx1 kanaler av en genetisk strategi (knock-out-möss) eller minska Panx1 kanalaktivitet genom farmakologisknärmar reducerad kollageninducerad trombocytaggregation 7. Panx1 bildar ATP-frisättning kanaler, som ubiquitously uttrycks i många celltyper inkluderande humana trombocyter 7, 8. I själva verket, vi visat genom turbidimetri på human tvättade blodplättar som en 7 min förinkubation med en panel av mera eller mindre specifika kemiska blockerare (probenecid, meflokin och 10 Panx1 peptider) före tillsats av olika agonister, inhiberade specifikt kollageninducerad trombocytaggregation medan blodplättar svar på AA och ADP inte påverkades. Vi visat att ATP-frisättning genom Panx1 kanaler specifikt interfererar i GPVI signalväg som leder till kollagen-inducerad aggregation. Interestingly, multipla FDA-godkända föreningar med tillämpningar inom andra sjukdomar (probenecid, meflokin) påverka aktiviteten hos Panx1 kanaler i trombocyter. Å ena sidan, öppnar detta nya terapeutiska perspektiv att väljaively modifiera blodplätts reaktivitet. Å andra sidan, bör man överväga eventuella bieffekter av dessa föreningar. I detta sammanhang, den säkra livsmedel färgämnet Brilliant Blue FCF används i multipla karameller och energidrycker har beskrivits som en selektiv hämmare av Panx1 9. Vi beskriver här ett protokoll för isoleringen av humana tvättade blodplättar och turbidimetriska mätningar av trombocytaggregation anpassad att undersöka effekten av den Brilliant Blue FCF färgämne som en antagonist av trombocytaggregation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett stort intresse för att hitta nya läkemedel som kan modulera blodplättarnas funktion för att förhindra trombos utan att öka risken för blödningar. För detta ändamål in vitro laboratorietester som tillförlitligt och reproducerbart kan övervaka aggregering svar i humana trombocyter är absolut nödvändiga. Turbidimetrisk aggregometri är en enkel teknik för att utföra. Men vissa försiktighetsåtgärder måste hållas i åtanke. Mätningarna måste utföras under kontinuerlig omrörin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av anslag från den schweiziska National Science Foundation (310030_162579 / 1 till Brenda Renata Kwak och 320030_144150 till Pierre Fontana) samt av ett bidrag från den schweiziska Heart Foundation.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
