Turbidimetri on Human vaskede blodplater: effekten av den Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF på Kollagen-indusert aggregasjon
Summary
Vi beskriver en grei metode for isolering av vaskede blodplater fra humant blod, etterfulgt av agonist-indusert blodplateaggregasjon målinger ved hjelp av turbidimetri. Som et eksempel kan vi anvende denne metode for å studere aggregeringsrespons av humane blodplater til kollagen etter en forinkubering med Pannexin1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri er en laboratorieteknikk som brukes for å måle aggregering av blodplatene suspendert i enten plasma (blodplaterikt plasma, PRP) eller i buffer (vaskede blodplater), ved anvendelse av en eller en kombinasjon av agonister. Bruken av vaskede blodplater separert fra sitt plasma miljø og i fravær av antikoagulanter gir mulighet for å studere indre plateegenskaper. Blant de stort panel av agonister, arakidonsyre (AA), adenosin-di-fosfat (ADP), trombin og kollagen er den mest brukte. Aggregeringen respons kvantifiseres ved å måle den relative optiske tetthet (OD) over tid av blodplatesuspensjonen under kontinuerlig omrøring. Blodplater i homogen suspensjon begrense passasjen av lys etter tilsats av en agonist, oppstår blodplate-formendring som produserer en liten forbigående økning i OD. Efter denne innledende aktiveringstrinn, blodplateklumper danner gradvis, slik at passasje av lys gjennom suspensjonen som en result av redusert OD. Aggregeringen prosessen er til syvende og sist uttrykt som en prosentandel i forhold til OD for blodplatefattig plasma eller buffer. Streng kalibrering er således vesentlig ved begynnelsen av hvert forsøk. Som en generell regel: kalibrering til 0% er angitt ved måling av OD av en ikke-stimulert blodplate-suspensjonen under måling av OD av suspensjonsmedium som ikke inneholder noen blodplater representerer en verdi på 100%. Blodplateaggregering vanligvis visualiseres som en sanntids aggregering kurve. Turbidimetri er en av de mest brukte laboratorieteknikker for undersøkelse av blodplatefunksjon og er ansett som den historiske gullstandarden og som brukes for utvikling av nye farmasøytiske midler som tar sikte på å inhibere blodplate-aggregering. Her beskriver vi detaljerte protokoller for 1) Fremstilling av humane vaskede blodplater og 2) turbidimetrisk analyse av kollagenfremkalt aggregering av humane vaskede blodplater forbehandlet med maten fargestoff Brilliant Blue FCF som var nylig idenserte som en inhibitor av Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Blodplater er viktige komponenter i blodet, og deres hovedfunksjon-sammen med koagulasjonsfaktorer-er for å stoppe blødning etter blodkarskade. Blodplater er små (2-3 mm) anuclear fragmenter avledet fra megakaryocytter i benmargen 1. Blodplater sirkulere i ikke-aktivert tilstand, i løpet av hvilken de fremstår som linseformede strukturer. Ved avbrytelse av endotelet, blodplater samles til stedet for blod karskade å plugge igjen hullet, en prosess som kalles primær hemostase. Til å begynne med, blodplater fester seg til sub-endotel-molekyler, slik som kollagen og von Willebrand faktor, som er eksponert som et resultat av skaden-adhesjon trinn 2. Deretter ble de endrer form og skiller kjemiske budbringere-aktiveringstrinn. Til slutt, de er koblet til hverandre ved å bygge bro reseptorer-aggregering trinn. Primære hemostase er etterfulgt av en sekundær prosess som involverer aktivering av koagulasjonskaskaden med fibrinavsetning, som stabiliserers den innledende tromben 2.
Akutte iskemiske hendelser slik som myokardialt infarkt tre ofte et resultat av tromber som dannes på grunn av fysisk forstyrrelse (ruptur) av et aterosklerotisk plakk. Nåværende platehemmende legemidler er hjørnesteinen i behandling av denne utbredt sykdom, men deres klinisk nytte er begrenset av en økt risiko for blødning. De mest foreskrevne medikamenter i kardiovaskulære pasienter, aspirin og anti-P2Y12-forbindelser, målrette tromboksan A2 og ADP trasé 4, henholdsvis, som er de viktigste reaksjonsveier som fører til blodplateaktivering. Men er nyskapende forskning mot nye mål som ville optimalt balansere antitrombotiske effekter og haemorragic risiko fortsatt nødvendig.
Fra 1960-tallet 5 til i dag, har turbidimetrisk aggregometribuffer spilt en avgjørende rolle i forskning, styrke vår kunnskap om plate reaktivitet og jegn overvåking av styrken av anti-trombotiske reagenser hos mennesker. Turbidimetri ble først påført på PRP utvunnet fra blodprøver. Faktisk, blodoppsamlings utført i rør inneholdende citrat tillater rask og stor produksjon av PRP uten å ha noen effekt på blodplate integritet og funksjon. Imidlertid er den kortvarige stabilitet (ca. 3 timer) av PRP og de gjenværende plasmatiske enzymer, slik som trombin, og den lave kalsiumkonsentrasjonen forbundet med potensielt arte aggregering profiler er av vesentlig ulempe for bruk av PRP. Et viktig steg fremover har vært utviklingen av en metode for blodplate isolasjon med ytterligere sentrifugering og vasking trinn 6. Kort sagt, blir PRP isolert fra fullblod oppsamlet på syre-citrat-dextrose (ACD), og blodplater blir isolert etter seriesentrifugeringstrinn før de ble resuspendert i et iso-osmotisk fosfatbuffer (Tyrodes buffer) inneholdende glukose, humant serumalbumin og toverdig casjon (Ca2 + og Mg2 +). For å unngå endringer i blodplatene, blir pH i Tyrodes buffer omhyggelig holdt ved 7,35 til 7,4. Videre er uønsket aktivering av blodplater forhindres ved å tilsette prostacyklin (PGI2) før noen sentrifugeringstrinn. Endelig gjør tilsetning av apyrase forhindrer vaskede blodplater fra å bli motstandsdyktig mot virkningen av ATP / ADP. Den resulterende blodplatesuspensjonen mangler koagulerende faktorer, og stabiliteten av blodplater blir øket med minst to-ganger sammenlignet med PRP-løsninger. I tillegg er det faktum at blodplater ikke er virksomme, men intakte garanterer reproduserbarheten av turbidimetriske målinger og gir mulighet til å studere virkningen av agonister eller antagonister for blodplate-aggregering på en optimal måte.
Ved hjelp av denne metode, har vi vist i en nylig undersøkelse at hemming av dannelsen av Panx1 kanaler ved hjelp av en genetisk metode (knock-out mus) eller avtagende Panx1 kanal aktivitet av farmakologisknærmer redusert collagen-indusert blodplate-aggregering 7. Panx1 danner ATP-frigjøringskanaler, som er ubikvitært uttrykt i mange celletyper, inkludert humane blodplater 7, 8. Faktisk viste vi ved turbidimetri på humane vaskede blodplater som en 7 min forhåndsinkubering med et panel av mer eller mindre bestemte kjemiske blokkere (probenecid, meflokin og 10 Panx1 peptider) før tilsetning av forskjellige agonister, hemmet spesielt kollagen-indusert blodplateaggregasjon mens blodplate responser til AA og ADP ikke ble påvirket. Vi demonstrerte at ATP-frigjøring ved Panx1 kanaler griper spesifikt i GPVI signalveien som fører til kollagen-indusert aggregering. Interessant, multiple FDA-godkjente forbindelser med anvendelser innenfor andre sykdommer (probenecid, meflokin) påvirke aktiviteten til Panx1 kanaler i blodplater. På den ene siden åpner dette nye terapeutiske perspektiver å velgeively modifisere blodplatene. På den annen side bør man vurdere potensielle sekundære virkninger av disse forbindelser. I denne sammenheng er sikker mat fargestoff Brilliant Blue FCF brukes i flere godteri og energidrikker har blitt beskrevet som en selektiv inhibitor for Panx1 9. Vi beskriver her en protokoll for isoleringen av humane vaskede blodplater og turbidimetriske målinger av blodplate-aggregering tilpasset for å undersøke effekten av den Brilliant Blue FCF fargestoff som en antagonist for blodplate-aggregering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er stor interesse for å finne nye legemidler som er i stand til å modulere blodplatefunksjonen for å forebygge trombose uten å øke risikoen for blødning. For dette formål in vitro laboratorieforsøk som på en pålitelig og reproduserbart kan overvåke aggregering reaksjoner i humane blodplater er absolutt nødvendig. Turbidimetrisk aggregometribuffer er en enkel teknikk for å utføre. Men noen forholdsregler må tas i betraktning. Målingene må utføres under kontinuerlig omrøring som aggregering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den sveitsiske National Science Foundation (310030_162579 / 1 til Brenda Renata Kwak og 320030_144150 til Pierre Fontana) samt av en bevilgning fra den sveitsiske Heart Foundation.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics–2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4′,4”,4”’-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E. Platelet aggregation: turbidimetric measurements. Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L., et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?. FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
