5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em> במבחנה</em
Summary
אנו מציגים שיטה לכמת מתילציה דנ"א מבוסס על 5-methylcytosine (5-mC) כתם נקודה. קבענו את רמות 5-mC במהלך dedondferentiation chondrocyte. טכניקה פשוטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע במהירות את הפנוטיפ chondrocyte בטיפול ACI.
Abstract
Dedifferentiation של chondrocytes hyaline לתוך chondrocytes fibroblastic מלווה לעתים קרובות הרחבת monolayer של chondrocytes במבחנה . רמת מתילציה דנ"א גלובלית של chondrocytes נחשבת ביומרקר מתאים לאובדן פנוטיפ chondrocyte. עם זאת, התוצאות על בסיס שיטות ניסיוניות שונות יכול להיות עקבי. לכן, חשוב להקים שיטה מדויקת, פשוטה, מהירה לכמת רמות מתילציה דנ"א העולמי במהלך dedondferentiation chondrocyte.
גנום רחב מתילציה ניתוח טכניקות רחב להסתמך בעיקר על רצף גנומי bisulfite. בשל השפלה דנ"א במהלך המרה bisulfite, שיטות אלה בדרך כלל דורשים נפח מדגם גדול. שיטות אחרות המשמשות לכמת רמות מתילציה דנ"א עולמיות כוללות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). עם זאת, HPLC דורש עיכול שלם של DNA גנומי. בנוסף, עלות גבוהה באופן בלתי נמנע של HPLC בStruments מגבילה את היישום הרחב יותר של HPLC.
במחקר זה, DNA גנומי (gDNA) הופק מן chondrocytes האדם מתורבת עם מספר משתנה של מעברים. רמת מתילציה gDNA זוהה באמצעות assay כתם methylation ספציפיים כתם. בגישה זו כתם נקודה, תערובת gDNA המכיל את ה- DNA methylated להיות מזוהים זוהה ישירות על קרום N + כנקודת בתוך תבנית תבנית מעגלית בעבר. לעומת ג 'ל אחרים מבוססי אלקטרופורזה גישות מתקדמות נהלים מסובכים אחרים, שיטת כתם נקודה חוסך זמן משמעותי. בנוסף, כתמים נקודה יכול לזהות את רמת מתילציה DNA הכולל באמצעות נוגדן זמין מסחרית 5-mC. מצאנו כי רמת מתילציה דנ"א נבדלה בין תת תרבויות monolayer, ולכן יכול לשחק תפקיד מפתח chondrocyte dedifferentiation. הכתם 5-mC נקודה היא שיטה אמינה, פשוטה, מהירה כדי לזהות את רמת מתילציה DNA הכללית להערכתהפונטיפ chondrocyte.
Introduction
השתלת chondrocyte אוטולוגי (ACI) הוא חדש יחסית, המדינה- of-the-art הליך לטיפול מומים סחוס מפרקי 1 , 2 . אחד הצעדים החשובים ב- ACI הוא הגברה של chondrocytes באמצעות תרבות monolayer במבחנה . במהלך הגברה, chondrocytes hyaline בקלות לאבד פנוטיפ שלהם ולהפוך dedifferentiated, וזה לא רצוי לטיפול ACI 3 , 4 . כדי למטב את התוצאה של טיפול ACI, יש לקבוע את מידת ההסתגלות של כונדרוציטים לפני החזרה. זה הכרחי להקים דרך כלכלית מהירה לקבוע את המעמד של chondrocytes. לאחרונה, הקשר בין מתילציה DNA ו dedifferentiation chondrocyte משכה תשומת לב רבה 4 , 5 , 6 . מתילציה דנ"א הוא תהליך של WHIch קבוצות מתיל מתווסף DNA, וכתוצאה מכך המרה של שאריות ציטוזין ל 5-methylcytosine (5-mC).
כדי להבהיר את הביולוגיה של מתילציה דנ"א ב dedifferentiation chondrocyte, הצעד הראשון הוא להעריך את רמת מתילציה DNA של chondrocytes, אשר עד כה הוכיחה אתגר. Bisulfite גנומי רצף היא הטכניקה הנפוצה ביותר לנתח מתילציה DNA 7 , 8 . ב assay זה, המרה bisulfite גורם השפלה DNA, ולכן כמות משמעותית של המדגם חייב להינתן assay. כמו כן, ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) שימשה לכימות רמות מתילציה דנ"א העולמי 9 , 10 . עם זאת, ניתוח HPLC דורש עיכול דנ"א גנומי. בנוסף, נדרשים מכשירים ניסיוניים מתקדמים ויקרים. לכן, בנוסף עלות גבוהה, הליכים אלה הם ניסיוני חסרונות זמןUming. נוגדנים אנטי-5-mC הפכו כעת זמינים מסחרית, אשר יצרה את האפשרות לחסינות חיסונית של דנ"א גנומי 5-cc המכיל גנומים מורכבים.
בדו"ח זה, אנו חילוץ DNA גנומי chondrocytes גדל בסדרה של תרבויות monolayer. השתמשנו assay כתם נקודה כדי להעריך את התוכן 5-mC ב chondrocytes האדם עם מספר שונה של מעברים. מצאנו כי 5-mC התוכן היה גדל chondrocytes מאוד dediferentiated לעומת chondrocytes עם dedifferentiation ברמה נמוכה. בנוסף, זיהינו מערכת יחסים בין מצב דיפוזיציה לבין רמות 5-mC. לבסוף, דיווחנו כי השינויים בתוכן 5-mC היו קשורים הפנוטיפ chondrocyte. לכן, 5-mC נקודה כתם assay היא שיטה אמינה, פשוטה, מהירה כדי לזהות את רמת מתילציה DNA chondrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chondrocyte dedifferentiation במבחנה פוגעת קשות את התוצאה של ACI בטיפול תיקון פגם סחוס 11 , 12 . כדי לייעל את התוצאה ACI, חשוב כדי למנוע את השימוש chondrocytes dediferentiated 13 . מחקרים הראו כי רמה כללית מתילציה דנ"א קשורה במידה של dedondferentiation chondrocyte <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: קרן המדע הטבעי של סין (מס '81572198, מס' 81260161, מס '81000460); הקרן למדעי הטבע של גואנגדונג, סין (No. 2015A030313772); סין פרויקט קרן פוסט-דוקטורט של קרן המדע הפוסט-דוקטורט (מס '2013M530385); קרן המחקר הרפואי של פרובינציית גואנגדונג, סין (מס 'A2016314); שנזן מדע וטכנולוגיה פרוייקטים (מס 'JCYJ20160301111338144, מס' JSGG20151030140325149, מס 'JSGG20140519105550503, No.GJHZ20130412153906739, מס' JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
