Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов<em> In Vitro</em
Summary
Мы представляем метод количественного метилирования ДНК на основе 5-methylcytosine (5-mC) дот-блоттинга. Мы определили уровни 5 мкС во время дедифференцировки хондроцитов. Этот простой метод может быть использован для быстрого определения фенотипа хондроцита при лечении ACI.
Abstract
Дедифференцировка гиалиновых хондроцитов в фибробластные хондроциты часто сопровождает монослое экспансии хондроцитов in vitro . Глобальный уровень метилирования ДНК хондроцитов считается подходящим биомаркером для потери фенотипа хондроцита. Однако результаты, основанные на различных экспериментальных методах, могут быть непоследовательными. Поэтому важно установить точный, простой и быстрый метод количественного определения уровней глобального метилирования ДНК во время дедифференцировки хондроцитов.
Современные методы анализа метилирования по всему геному в значительной степени основаны на геномном секвенировании бисульфита. Из-за деградации ДНК во время конверсии бисульфита эти методы обычно требуют большого объема образца. Другие методы, используемые для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК, включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Однако ВЭЖХ требует полного переваривания геномной ДНК. Кроме того, непомерно высокая стоимость ВЭЖХ вИнструменты ограничивают широкое применение ВЭЖХ.
В этом исследовании геномную ДНК (гДНК) экстрагировали из человеческих хондроцитов, культивируемых с различным количеством пассажей. Уровень метилирования gDNA определяли с использованием специфического для метилирования теста дот-блоттинга. В этом методе дот-блоттинга смесь gDNA, содержащая метилированную ДНК, которая должна быть обнаружена, была обнаружена непосредственно на мембране N + в виде точки внутри ранее нарисованного кругового шаблона шаблона. По сравнению с другими методами блоттинга на основе гель-электрофореза и другими сложными методиками блоттинга метод дот-блоттинга экономит значительное время. Кроме того, дот-блоты могут обнаруживать общий уровень метилирования ДНК с использованием коммерчески доступного антитела с 5 мК. Мы обнаружили, что уровень метилирования ДНК различается между однослойными субкультурами и поэтому может играть ключевую роль в дедифференцировании хондроцитов. 5-МТ дот-блот является надежным, простым и быстрым методом для определения общего уровня метилирования ДНК для оценкиФенотип хондроцитов.
Introduction
Аутологичная имплантация хондроцитов (ACI) – относительно новая, современная методика лечения дефектов суставного хряща 1 , 2 . Одним из важнейших этапов ACI является амплификация хондроцитов посредством монослойной культуры in vitro . Во время амплификации гиалиновые хондроциты легко теряют свой фенотип и становятся дедифференцированными, что нежелательно для лечения ACI 3 , 4 . Чтобы оптимизировать результаты лечения ACI, степень дедифференцировки хондроцитов должна быть определена перед реплантацией. Крайне важно установить экономичный и быстрый способ определения статуса хондроцитов. Недавно ассоциация между метилированием ДНК и дедифференцировкой хондроцитов привлекла большое внимание 4 , 5 , 6 . Метилирование ДНК – это процесс by whМетильные группы добавляют к ДНК, приводя к превращению остатков цитозина в 5-метилцитозин (5-mC).
Чтобы выяснить биологию метилирования ДНК в дедифференцировке хондроцитов, первым шагом является оценка уровня метилирования ДНК хондроцитов, который до сих пор оказался сложным. Бисульфитное геномное секвенирование является наиболее широко используемым методом анализа метилирования ДНК 7 , 8 . В этом анализе конверсия бисульфита вызывает деградацию ДНК, и поэтому для анализа необходимо предоставить значительное количество образца. Кроме того, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК 9 , 10 . Однако анализ ВЭЖХ требует переваривания геномной ДНК. Кроме того, необходимы передовые и дорогостоящие экспериментальные приборы. Поэтому, помимо высокой стоимости, эти экспериментальные процедуры являются временными минусамиели. Анти-5-mC-антитела стали коммерчески доступными, что создало возможность иммунного блоттинга геномной ДНК, содержащей 5 мкл, из сложных геномов.
В этом сообщении мы извлекли геномную ДНК из хондроцитов, выращенных в серии монослойных культур. Мы использовали дот-блот-анализ для оценки содержания 5 мК в человеческих хондроцитах с различным количеством проходов. Мы обнаружили, что содержание 5-мС увеличилось в сильнодедифференцированных хондроцитах по сравнению с хондроцитами с низкодифференцированной дедифференцировкой. Кроме того, мы установили связь между статусом дедифференцировки и уровнем 5 мкС. Наконец, мы сообщили, что изменения в содержании 5 мкС были связаны с фенотипом хондроцитов. Таким образом, 5-МЦ дот-блот-анализ является надежным, простым и быстрым методом для определения уровня метилирования ДНК в хондроцитах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дедифференцировка хондроцитов in vitro сильно компрометирует результаты ACI при лечении дефектов хрящевых дефектов 11 , 12 . Для оптимизации результатов ACI крайне важно избегать использования дедифференцированных хондроцитов 13 . Исследовани…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана следующими грантами: Фонд естественных наук Китая (№ 81572198, № 81260161, № 81000460); Фонд естественных наук провинции Гуандун, Китай (№ 2015A030313772); Финансируемый Китаем научный фонд (№ 2013М530385); Фонд медицинских исследований провинции Гуандун, Китай (№ A2016314); Шэньчжэньский научно-технический проект (№ JCYJ20160301111338144, № JSGG20151030140325149; № JSGG20140519105550503; №GJHZ20130412153906739; № JCYJ20140414170821160; №JCYJ20140414170821200).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
