5-एमसी डॉट ब्लाट परख डीएनए मेथिलिकेशन लेवल ऑफ़ चॉन्ड्रोसाइट डिडिएफेनिफिकेशन<em> विट्रो में</em
Summary
हम 5-मेथिलसीटोसिन (5-एमसी) डॉट ब्लोट के आधार पर डीएनए मेथिलिकेशन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हमने chondrocyte dedifferentiation के दौरान 5-एमसी स्तर निर्धारित किया था। एसीआई उपचार में chondrocyte phenotype को शीघ्रता से निर्धारित करने के लिए यह सरल तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
फाइब्रोब्लास्टिक chondrocytes में हाइलाइन चांड्रोसाइट्स का ब्योरा अक्सर इन विट्रो में चॉन्ड्रोसाइट्स के मोनोलेयर विस्तार के साथ होता है । Chondrocytes के वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर को chondrocyte phenotype के नुकसान के लिए एक उपयुक्त बायोमार्कर माना जाता है। हालांकि, विभिन्न प्रयोगात्मक विधियों के आधार पर परिणाम असंगत हो सकते हैं। इसलिए, chondrocyte dedifferentiation के दौरान वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सटीक, सरल, और तेज़ तरीका स्थापित करना महत्वपूर्ण है।
वर्तमान जीनोम चौड़ा मेथिलिकेशन विश्लेषण तकनीक बड़े पैमाने पर बिसल्फाइट जीनोमिक अनुक्रमण पर भरोसा करती है। बायसफ़ाइट रूपांतरण के दौरान डीएनए गिरावट के कारण, इन तरीकों के लिए आम तौर पर बड़े नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है। वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों को मापने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले अन्य तरीकों में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) शामिल हैं। हालांकि, एचपीएलसी जीनोमिक डीएनए के पूर्ण पाचन की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, एचपीएलसी की निषेधात्मक रूप से उच्च लागत मेंस्ट्रिपर्स एचपीएलसी के व्यापक आवेदन को सीमित करता है।
इस अध्ययन में, जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) मानवीय क्रॉन्ड्रोसाइट्स से अलग-अलग संख्याओं के साथ निकाले गए थे। मेथिलैशन-विशिष्ट डॉट ब्लोट परख का उपयोग करते हुए जीडीएनए मेथिलैलेशन स्तर का पता लगाया गया था। इस डॉट ब्लाट दृष्टिकोण में, मैथिलेटेड डीएनए युक्त एक जीडीएनए मिश्रण को सीधे एक एन + झिल्ली पर देखा गया था जो पहले खींची गई परिपत्र टेम्पलेट पैटर्न के अंदर एक बिंदु के रूप में देखा गया था। अन्य जेल वैद्युतकणसंचलन-आधारित ब्लूटिंग दृष्टिकोण और अन्य जटिल ब्लोटिंग प्रक्रियाओं के मुकाबले, डॉट ब्लॉट विधि महत्वपूर्ण समय बचाता है। इसके अलावा, डॉट बोट्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5-एमसी एंटीबॉडी का उपयोग करके पूरे डीएनए मेथिलैलेशन स्तर का पता लगा सकते हैं। हमने पाया है कि डीएनए मेथिलैशन स्तर मोनोलायर उप-संस्कृतियों के बीच मतभेद है, और इसलिए चोंद्रासाइट डिटेफेक्शनेशन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। 5-एमसी डॉट ब्लाक एक विश्वसनीय, सरल और तेजी से तरीका है जो सामान्य डीएनए मेथिलिकेशन स्तर का मूल्यांकन करने के लिए हैई क्रॉन्ड्रोसाइट फेनोटाइप
Introduction
ऑटोलॉगस चॉन्ड्रोसाइट इम्प्लांटेशन (एसीआई) एक अपेक्षाकृत नई, अत्याधुनिक प्रक्रियात्मक कार्टिलेज दोष 1 , 2 के उपचार के लिए है। एसीआई में महत्वपूर्ण कदमों में से एक इन विट्रो में मोनोलयर संस्कृति के माध्यम से चांड्रोसाइट्स का प्रवर्धन है। प्रवर्धन के दौरान, संकर चोंद्रोसाइट्स आसानी से अपने फेनोटाइप खो देते हैं और डीडीआई उपचार 3 , एसीआई उपचार के परिणाम का अनुकूलन करने के लिए, चोंद्रेसाइट dedifferentiation की सीमा प्रतिस्थापन से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए। Chondrocytes की स्थिति निर्धारित करने के लिए आर्थिक और तेज़ तरीका स्थापित करना जरूरी है I हाल ही में, डीएनए मेथिलैशन और चांड्रोसाइट डिसीफाइनेशन के बीच के सम्बन्ध ने 4 , 5 , 6 के बारे में ज्यादा ध्यान आकर्षित किया है। डीएनए मेथिलिकेशन क द्वारा प्रक्रिया हैआईआईएच मिथाइल समूहों को डीएनए में जोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप साइटोसिन अवशेषों के 5-मेथिलसायटोसिन (5-एमसी) में रूपांतरण होता है।
Chondrocyte dedifferentiation में डीएनए मेथिलिकेशन के जीव विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए, पहला कदम है चांड्रोसाइट्स के डीएनए मेथिलिकेशन स्तर का मूल्यांकन करना, जो अभी तक चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। डीएसए मेथाइलेशन 7 , 8 का विश्लेषण करने के लिए बीसफ़ाफाइट जीनोमिक अनुक्रमण सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। इस परख में, bisulfite रूपांतरण डीएनए गिरावट का कारण बनता है, और इस प्रकार नमूने की एक पर्याप्त मात्रा परख के लिए प्रदान किया जाना चाहिए। इसके अलावा, उच्चतर प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर 9 , 10 का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, एचपीएलसी विश्लेषण जीनोमिक डीएनए पाचन की आवश्यकता है। इसके अलावा, उन्नत और महंगा प्रायोगिक उपकरणों की आवश्यकता है। इसलिए, उच्च लागत के अतिरिक्त, इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं समय पर विपक्ष हैंuming। एंटी-5-एमसी एंटीबॉडी अब वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं, जिसने जटिल जीनोम से 5 एमसी युक्त जीनोमिक डीएनए के प्रतिरक्षा ब्लूटिंग की संभावना पैदा कर दी है।
इस रिपोर्ट में, हमने मोनोलेयर संस्कृतियों की एक श्रृंखला में विकसित हुए चांड्रोसाइट्स से जीनोमिक डीएनए निकाला। हमने विभिन्न अंकों के साथ मानव चॉन्ड्रोसाइट्स में 5-एमसी सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए एक डॉट ब्लॉट परख का इस्तेमाल किया। हमने पाया है कि उच्च-वर्गीकृत chondrocytes में 5-एमसी सामग्री को कम ग्रेड डिडिफाइनेशन के साथ चॉन्ड्रोसाइट्स की तुलना में बढ़ाया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने अंतर-निर्धारण स्थिति और 5-एमसी स्तरों के बीच एक संबंध की पहचान की। अंत में, हमने बताया कि 5-एमसी सामग्री में परिवर्तन chondrocyte phenotype से जुड़े थे। इसलिए, 5-एमसी डॉट ब्लाट परख एक विश्वसनीय, सरल और तेजी से विधि है जो डीएनए मेथिलिकेशन स्तर को चांड्रोसाइट्स में पहचानती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में चांड्रोसाइट डिटेफेक्शनेशन, उपास्थि दोष की मरम्मत 11 , 12 के इलाज में एसीआई के परिणाम से गंभीर रूप से समझौता करता है। एसीआई परिणाम को अनुकूलित करने के लिए, डिफिफेन्फ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित था: चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 815721 9 8; नंबर 81260161; संख्या 81000460); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (सं। 2015 ए 3030313772); चीन पोस्टडोक्चरल साइंस फाउंडेशन फंडेड प्रोजेक्ट (संख्या 2013M530385); गुआंगडोंग प्रांत, चीन (नं .2016314) की मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन; शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं। JCYJ20160301111338144; सं। JSGG20151030140325149; सं। JSGG20140519105550503; सं। जीजेएचजेड20130412153906739; नहीं JCYJ20140414170821160; सं .जेसीवायजे20140414170821200)।
Materials
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965–092 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline(PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, free of |
| Ca2+/Mg2+ | |||
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0.25%Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1%Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Chloroform | Mallinckrodt | 4440 | |
| Isoamyl Alcohol | Sigma | I-3643 | |
| Phenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| TAE buffer | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Distilled Water | Gibco BRL | 15230-170 | |
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | C58H114O26 | |
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Names | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Cell Strainer(40μm nylon） | FALCON Inc. | 352340 | |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | |
| Centrifuge Tubes | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | |
| Chemi-imaging Analyse System | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
References
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
- Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
- Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
- Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , (2016).
- Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
- Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
- Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
- Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
- Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
- Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
- Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
- Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
- Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
