एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए
Summary
जीनोटाइपिंग तकनीक यहाँ वर्णित है, जो जोड़ों फ्लोरोसेंट पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (पीसीआर) जेल वैद्युतकणसंचलन केशिका, nuclease की मध्यस्थता नॉकआउट क्लोन के उच्च throughput जीनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है। यह अन्य जीनोटाइपिंग तकनीक को पेश आ रही सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न और अनुक्रमण तरीकों की तुलना में अधिक लागत प्रभावी है।
Abstract
प्रोग्राम जीनोम संपादन उपकरण के विकास रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग भूमिकाओं विशिष्ट जीनोमिक दृश्यों कोशिकाओं और पूरे जीवों के कामकाज में खेलने को समझने के लिए मदद की है। इस कारण काफी / Cas9 प्रणाली एक बहुमुखी उपकरण है कि शोधकर्ताओं, के क्रम में जीनोम और transcriptome हेरफेर करने के लिए अन्य बातों के अलावा, नॉक आउट, नीचे दस्तक, या एक लक्षित में जीन में दस्तक की अनुमति देता है CRISPR की हाल ही में परिचय द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है तौर तरीका। एक जीन बाहर दस्तक के प्रयोजन के लिए, CRISPR / Cas9 की मध्यस्थता डबल भूग्रस्त टूटता गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के डीएनए की मरम्मत मार्ग की भर्ती को तोड़ने स्थल पर frameshift के कारण प्रविष्टि या न्यूक्लियोटाइड का विलोपन लागू करने के लिए। हालांकि, एक व्यक्ति गाइड आरएनए अवांछनीय ऑफ-टारगेट प्रभाव का कारण हो सकता है, और इन से इनकार करने के लिए, कई गाइड RNAs के उपयोग आवश्यक है। लक्ष्यों की एक बहुतायत में भी मतलब है कि क्लोन के एक उच्च मात्रा स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है, जो बारी में एक एफई के उपयोग भीख माँगताउच्च throughput तकनीक ficient नॉकआउट क्लोन जीनोटाइप के लिए। वर्तमान जीनोटाइपिंग तकनीक या तो निहित सीमाओं से ग्रस्त हैं या उच्च लागत उठाना, इसलिए उन्हें उच्च throughput उद्देश्यों के लिए अनुपयुक्त हो जाता है। यहाँ, हम विस्तार फ्लोरोसेंट पीसीआर, जो एक टेम्पलेट के रूप में कच्चे तेल की सेल lysate से जीनोमिक डीएनए का उपयोग करता है का उपयोग कर, और फिर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से पीसीआर टुकड़े हल करने के लिए प्रोटोकॉल। इस तकनीक को काफी सही टुकड़े के बीच एक आधार जोड़ी अंतर अंतर करने के लिए है और इसलिए लक्षित जीन की कोडिंग अनुक्रम में उपस्थिति या frameshift के अभाव का संकेत में पर्याप्त है। यह सटीक ज्ञान को प्रभावी ढंग से पुष्टिकारक अनुक्रमण कदम के लिए की जरूरत precludes और उपयोगकर्ताओं की प्रक्रिया में समय और लागत को बचाने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक के रूप में यहाँ और कहीं और से पता चला, कई जीनों के खिलाफ गाइड RNAs द्वारा लक्षित विभिन्न ऊतक मूल के विभिन्न स्तनधारी कोशिकाओं जीनोटाइपिंग में बहुमुखी साबित हो गया है।
Introduction
रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण वैज्ञानिकों सेल या पूरे जीव पर जीनोम में विशिष्ट परिवर्तन की प्रभाव स्पष्ट करना अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, एक विशेष जीन की अभिव्यक्ति के क्रम प्रभाव है कि इस सेल की या पर समारोह पर है निर्धारित करने के लिए जीन नॉकडाउन 1, 2 (आंशिक कमी) या जीन नॉकआउट 3, 4 (पूरा पृथक) द्वारा तनु किया जा सकता है जीव के विकास।
जीन नॉकआउट प्रयोगों ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) के रूप में अनुक्रम विशेष प्रोग्राम न्युक्लिअसिज़, की शुरूआत के बाद आसान हो गए हैं। हालांकि, नियमित रूप से कम मुरजबंध संबंधी दोहराने (CRISPR) बीच-बीच में क्लस्टर के अपेक्षाकृत हाल ही में लक्षण वर्णन / Cas9 प्रणाली यह बहुत आसान दुनिया भर में किसी भी प्रयोगशाला जनरल प्रदर्शन करने के लिए बना दिया हैई नॉकआउट प्रयोगों। संक्षेप में, CRISPR / Cas9 प्रणाली के दो आवश्यक घटक-एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) है, जो पहचानता है और जीनोम में एक विशिष्ट क्रम में करने के लिए आधार संपूरकता के माध्यम से बांधता है, और एक endonuclease Cas9 कहा जाता है के होते हैं। जीनोमिक डीएनए पर sgRNA-Cas9 परिसर के विशिष्ट बंधन और कार्रवाई के बाद डीएनए की डबल भूग्रस्त दरार है। यह, बारी में, सेल, जो बाद में गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) या समरूप पुनर्संयोजन (एचआर) रास्ते के माध्यम से ठीक किया जाता है में डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया तंत्र से चलाता है। के बाद से NHEJ मरम्मत तंत्र (लेकिन मानव संसाधन तंत्र) अक्सर मरम्मत के स्थल पर यादृच्छिक प्रविष्टि या न्यूक्लियोटाइड को हटाए जाने का परिणाम, प्रविष्टि / विलोपन (INDEL) म्यूटेशन में जिसके परिणामस्वरूप, यह एक एक्सॉन के पढ़ने के फ्रेम शिफ्ट करने के लिए कारण हो सकता है। यह तो, अनुवाद और बकवास की मध्यस्थता क्षय 5, 6 के समय से पहले समाप्ति की वजह से जीन के नॉक आउट में हो सकता है7।
सुविधा एक जीन बाहर दस्तक में CRISPR / Cas9 प्रणाली की शुरुआत द्वारा प्रदान के बावजूद, लक्षित कोशिकाओं के क्लोन की जीनोटाइपिंग विशेष रूप से एक उच्च प्रवाह क्षमता 8, 9 की स्थापना में अड़चन बनी हुई है,। मौजूदा तकनीक या तो प्रमुख निहित सीमाओं पीड़ित हैं या आर्थिक रूप से महंगा है। उदाहरण के लिए, सर्वेक्षक या T7E1 परख है, जो एक एंजाइमी परख कि डुप्लेक्स 10 डीएनए में बेमेल का पता लगाता है, wildtype क्लोन और समयुग्मक उत्परिवर्ती के बीच भेद करने में सक्षम नहीं है (क्लोन जिसका युग्मविकल्पी हूबहू उत्परिवर्तित कर रहे हैं), क्योंकि ये क्लोन समान जेनेटिक तत्व है और इस तरह उनके डीएनए अनुक्रम 11 में बेमेल पेश नहीं करते। इसके अलावा, सेंगर अनुक्रमण, जो उत्परिवर्ती क्लोन जीनोटाइपिंग, एक उच्च throughput सेटअप में में स्वर्ण मानक माना जाता के उपयोग इसकी ऊंची कीमत की वजह से अवांछनीय है। यहाँ, हम एक det पेशफ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक है, जो अन्य मौजूदा जीनोटाइपिंग तकनीक की सीमाओं को दरकिनार और nuclease की मध्यस्थता नॉकआउट क्लोन के एक उच्च throughput स्क्रीन प्रदर्शन में विशेष रूप से उपयोगी है सकते हैं की ailed प्रोटोकॉल। इस विधि को करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है और समय और लागत की बचत होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पसंद का एक मॉडल सेल लाइन में एक विशिष्ट जीन से बाहर दस्तक भूमिका का वर्णन है कि जीन कि विशेष रूप से सेलुलर संदर्भ में नाटकों के लिए नियमित बन गया है। वास्तव में, कई जीनोम चौड़ा स्क्रीन वर्तमान में जीनोम <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन प्रयोगों के साथ मदद करने के लिए सुश्री टैन शि मिन, सुश्री हेलेन ओंग, और डॉ झाओ यी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम NMRC / IRG द्वारा समर्थित किया गया NMRC / 1314/2011 और MOE AcRF टीयर 2 कोष अनुदान MOE2011-T2-1-051 अनुदान।
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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