Analyses histologiques de lésions hépatiques alcooliques aiguës dans le poisson zébré
Summary
Ce protocole décrit des analyses histologiques des foies provenant de larves de poissons zèbres qui ont été traitées avec 2% d'éthanol pendant 24 h. Un tel traitement aigu de l'éthanol entraîne une stéatose hépatique et un gonflement du système vasculaire hépatique.
Abstract
La maladie du foie alcoolique (ALD) désigne des lésions hépatiques causées par l'abus d'alcool aigu ou chronique. Il est parmi les principales causes de la morbidité et de la mortalité liés à l'alcool et touche plus de 2 millions de personnes aux États-Unis. Une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les lésions hépatiques induites par l'alcool est cruciale pour développer un traitement efficace pour l'ALD. Les larves de zébrés présentent une stéatose hépatique et une fibrogénèse après seulement 24 heures d'exposition à 2% d'éthanol, ce qui les rend utiles pour l'étude d'une lésion hépatique alcoolique aiguë. Ce travail décrit la procédure pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et montre qu'il provoque une stéatose et un gonflement des vaisseaux sanguins hépatiques. Un protocole détaillé pour la coloration par hématoxyline et éosine (H & E) optimisé pour l'analyse histologique du foie larvaire du poisson zèbre est également décrit. La coloration H & E présente plusieurs avantages uniques par rapport à l'immunofluorescence, car elle marque tous les vivantsDes cellules er et des composants extracellulaires simultanément et peuvent facilement détecter une lésion hépatique, comme la stéatose et la fibrose. Compte tenu de l'utilisation croissante du poisson zèbre dans la modélisation de la toxine et des lésions hépatiques induites par un virus, ainsi que des maladies hépatiques héréditaires, ce protocole sert de référence aux analyses histologiques effectuées dans toutes ces études.
Introduction
La maladie du foie alcoolique (ALD), causée par la surconsommation d'alcool, est une cause majeure de morbidité et de mortalité liés à l'alcool. Aux États-Unis, près de la moitié des décès liés à une maladie du foie impliquent l'alcool 1 , et ALD est responsable de près de 1 fois sur 3 transplantations de foie 2 . ALD a un large spectre. La statose, qui se caractérise par une accumulation excessive de lipides dans les hépatocytes, se produit au stade précoce de la consommation excessive et est réversible lors de la cessation de la consommation d'alcool. Sous l'influence des facteurs génétiques et environnementaux et de la consommation continue d'alcool, la stéatose hépatique peut progresser vers l'hépatite alcoolique et, éventuellement, la cirrhose 3 . Les études utilisant les modèles ALD de rongeurs ont fourni des informations importantes sur la maladie, mais elles ont des limites (examinées dans la référence 3 ). L'alimentation orale d'un régime alcoolique provoque seulement une stéatose chez les rongeurs 4 , </ Sup> 5 . Le développement de l'inflammation et de la fibrose nécessite soit une deuxième insulte 6 , 7 soit une infusion intragastrique chronique, qui est envahissante et techniquement difficile 8 , 9 . Le pèlerin zélotechnique développe également une lésion hépatique en réponse au traitement à l'alcool chronique et aigu 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . En particulier, le poisson zèbre larvaire représente un organisme modèle complémentaire intéressant dans lequel étudier une lésion alcoolique aiguë du foie 10 , 11 , 13 , 15 . Le foie de poisson zèbre est fonctionnel et produit des enzymes clés pour le métabolisme de l'éthanol de 4 joursS post-fertilisation (dpf) 13 , 16 , 17. L' éthanol peut être ajouté directement à l'eau et l'exposition à 2% d'éthanol pendant 24 h est suffisante pour induire la stéatose hépatique et les réponses fibrogéniques dans les larves de poissons zèbres 13 , 15 .
Il a été rapporté que le traitement avec 2% d'éthanol pendant 24 h a entraîné une concentration en éthanol tissulaire de 80 mM dans les larves de poissons zèbres 13 . D'autres ont montré que les larves tolèrent cette concentration et que les phénotypes du foie observés chez les animaux traités sont spécifiques à l'exposition à l'éthanol 11 , 13 , 15 , 18 . Cependant, car 80 mM sont presque mortels chez les humains 19 , il est important d'évaluer l'histologie du foie du poisson zèbre traité par l'éthanol et de détecterRmine la pertinence physiologique pour les humains.
Le développement externe rapide et la translucide des larves de poissons zèbres permettent de caractériser l'action de l'alcool dans le foie en temps réel et dans des échantillons fixes. La disponibilité de lignes transgéniques fluorescentes spécifiques à un type de cellule et les progrès récents dans la microscopie confocale facilitent l'étude de la façon dont différents types de cellules hépatiques modifient leur morphologie et leur comportement en réponse au traitement aigu de l'éthanol 11 , 15 . Cependant, l'imagerie confocale du poisson zèbre transgénique fluorescent ne peut pas se substituer complètement à la coloration par l'hématoxyline et l'éosine (H & E) lors de l'étude de l'histologie du foie. Le marquage de tous les types de cellules hépatiques en même temps en utilisant du poisson zèbre transgénique nécessite la génération de lignes transgéniques individuelles, chacune étiquetant un type de cellule hépatique avec un fluorophore unique. L'introduction de différents milieux transgéniques dans le même poisson nécessite une élevageG générations multiples, qui prend beaucoup de temps et coûte cher. Une coloration immunofluorescence supplémentaire est nécessaire pour détecter les composants de la matrice extracellulaire. La coloration H & E, d'autre part, étiquette simultanément tous les types de cellules du foie et les composants de la matrice extracellulaire, fournissant ainsi une vue d'ensemble du foie 20 . De plus, il révèle facilement plusieurs caractéristiques histopathologiques des maladies du foie, telles que la mort des hépatocytes, la stéatose et la fibrose. Bien que H & E soit une tache de routine dans l'histologie du foie de mammifère, elle n'est pas couramment utilisée dans la recherche sur le foie du poisson zèbre et le protocole est moins bien établi.
Ce travail décrit un protocole pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et pour les analyses histologiques de suivi avec la coloration H & E. Le protocole de coloration H & E peut être utilisé dans toutes les études sur le développement et la fonction du foie. De plus, les sections de paraffine peuvent être utilisées pour l'immunohistochimie, ainsi que pour d'autres structures spécialesIns dans la pathologie du foie, y compris la tache de trichrome, la tache de réticuline, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel décrit une procédure détaillée pour le traitement aigu de l'éthanol dans les larves de poissons zèbres et les analyses histopathologiques suivantes avec la coloration H & E. Le traitement aigu de l'éthanol doit être effectué au plus tôt avant 96 heures après la fertilisation, car c'est le stade auquel le foie du poisson zébré commence à exprimer les enzymes métabolisant l'alcool 13 . 2% d'éthanol est la dose maximale que les larves peuve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Katy Murray au Zebrafish International Resource Centre; Dr. Stacey Huppert et Kari Huppert au CCHMC, pour leurs conseils utiles sur le protocole; Et le service vétérinaire CCHMC, pour les soins des poissons. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH R00AA020514 et une subvention de recherche du Centre for Pediatric Genomics au CCHMC (à CY). Il s'agissait également d'un soutien en partie par la subvention NIH D30103939 (Intégrative Morphology Core) du Centre de recherche sur les maladies digestives à Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
