Histologiske analyser af akut alkoholisk leverskader i sebrafisk
Summary
Denne protokol beskriver histologiske analyser af leverne fra zebrafisklarver, som er blevet behandlet med 2% ethanol i 24 timer. En sådan akut etanolbehandling resulterer i hepatisk steatosis og hævelse af den hepatiske vaskulatur.
Abstract
Alkoholisk leversygdom (ALD) henviser til skader på leveren på grund af akut eller kronisk alkoholmisbrug. Det er blandt de førende årsager til alkoholrelateret sygelighed og dødelighed og rammer mere end 2 millioner mennesker i USA. En bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for alkoholinduseret leverskade, er afgørende for at udvikle effektiv behandling af ALD. Zebrafish larver udviser hepatisk steatosis og fibrogenese efter blot 24 timers eksponering for 2% ethanol, hvilket gør dem nyttige til undersøgelse af akut alkoholisk leverskade. Dette arbejde beskriver proceduren for akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og viser, at det forårsager steatose og hævelse af de levermæssige blodkar. En detaljeret protokol for hematoxylin og Eosin (H & E) farvning, der er optimeret til den histologiske analyse af zebrafisk larver leveren, er også beskrevet. H & E-farvning har flere unikke fordele i forhold til immunofluorescens, da det markerer alt livEr celler og ekstracellulære komponenter samtidigt og kan let detektere leverskade, såsom steatose og fibrose. I betragtning af den stigende brug af zebrafisk i modelleringstoksin og virusinduceret leverskade samt arvelige leversygdomme, tjener denne protokol som reference for de histologiske analyser, der udføres i alle disse undersøgelser.
Introduction
Alkoholisk leversygdom (ALD), som er forårsaget af overkonsumtion af alkohol, er en væsentlig årsag til alkoholrelateret morbiditet og dødelighed. I USA involverer næsten halvdelen af leversygdødsfald alkohol 1 , og ALD er ansvarlig for næsten 1 ud af 3 levertransplantationer 2 . ALD har et bredt spektrum. Steatosis, som er præget af overskydende lipidakkumulering i hepatocytter, forekommer i det tidlige stadium af kraftigt drikke og er reversibel ved ophør af alkoholbrug. Under påvirkning af genetiske og miljømæssige faktorer og vedvarende alkoholindtag kan hepatisk steatosis udvikle sig til alkoholisk hepatitis og til sidst cirrose 3 . Undersøgelser, der bruger gnaver-ALD-modellerne, har givet en betydelig indsigt i sygdommen, men de har begrænsninger (gennemgået i reference 3 ). Mundtlig fodring af en alkoholdiæt forårsager kun steatose hos gnavere 4 , </ Sup> 5 . Udvikling af inflammation og fibrose kræver enten en anden fornærmelse 6 , 7 eller kronisk intragastrisk infusion, som er invasiv og teknisk udfordrende 8 , 9 . Den teleost zebrafish udvikler også leverskade som reaktion på både kronisk og akut alkoholbehandling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . I særdeleshed repræsenterer larvalzebrafisken en attraktiv komplementær modelorganisme, hvor man studerer akut alkoholisk leverskade 10 , 11 , 13 , 15 . Zebrafish leveren er funktionel og producerer nøgle enzymer til ethanol metabolisme med 4 dageS efter befrugtning (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan tilsættes direkte til vandet, og eksponering for 2% ethanol i 24 timer er tilstrækkelig til at inducere leverstatat og fibrogenrespons i zebrafisklarver 13 , 15 .
Det er blevet rapporteret, at behandling med 2% ethanol i 24 timer resulterede i en vævethanolkoncentration på 80 mM i zebrafisklarver 13 . Andre har vist, at larver tolererer denne koncentration, og leverfænotyperne set i de behandlede dyr er specifikke for ethanoleksponering 11 , 13 , 15 , 18 . Men fordi 80 mM er næsten dødelig hos mennesker 19 , er det vigtigt at evaluere leverhistologien af det ethanolbehandlede zebrafisk og deteRminere den fysiologiske relevans for mennesker.
Den hurtige eksterne udvikling og translucens af zebrafisk larver gør det muligt at karakterisere alkoholens påvirkning i leveren i realtid og i faste prøver. Tilgængeligheden af celletypespecifikke fluorescerende transgene linjer og de seneste fremskridt inden for konfokal mikroskopi letter undersøgelsen af, hvordan forskellige levercelletyper ændrer deres morfologi og adfærd som reaktion på akut ethanolbehandling 11 , 15 . Imidlertid kan konfokal billeddannelse af den fluorescerende transgene zebrafisk ikke fuldstændigt erstatte hematoxylin og Eosin (H & E) farvning, når man studerer leverhistologi. Markering af alle levercelletyper på samme tid ved brug af transgen sebrafisk kræver generering af individuelle transgene linjer, der hver mærker en levercelletype med en unik fluorofor. Introduktion af forskellige transgene baggrunde til samme fisk kræver raceinG flere generationer, hvilket er tidskrævende og dyrt. Yderligere immunofluorescensfarvning er nødvendig for at detektere ekstracellulære matrixkomponenter. H & E-farvning på den anden side markerer samtidig alle levercelletyper og ekstracellulære matrixkomponenter, hvilket giver et overblik over leveren 20 . Desuden afslører det let flere histopatologiske træk ved leversygdomme, såsom hepatocytdød, steatose og fibrose. Skønt H & E er en rutinemæssig plet i pattedyrets leverhistologi, er den ikke almindelig anvendt i zebrafiskleverforskning, og protokollen er mindre veletableret.
Dette arbejde beskriver en protokol til akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og til opfølgnings histologiske analyser med H & E-farvning. H & E-farvningsprotokollen kan anvendes i alle studier af leverudvikling og -funktion. Desuden kan paraffinsektionerne anvendes til immunhistokemi, såvel som for andre specielle staIns i leverpatologi, herunder trichrom-plet, reticulin-plet osv .
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en detaljeret procedure for akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og de efterfølgende histopatologiske analyser med H & E-farvning. Akut ethanolbehandling bør udføres senest 96 timer efter befrugtning, da dette er det stadium, hvor zebrafisklever begynder at udtrykke alkoholmetaboliserende enzymer 13 . 2% ethanol er den maksimale dosis, som larver kan tolerere 13 , 14 . De etanolbehandlede larve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Katy Murray på Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert og Kari Huppert på CCHMC, for deres nyttige råd om protokollen; Og CCHMC veterinærtjeneste, til fiskepleje. Dette arbejde blev støttet af NIH grant R00AA020514 og et forskningsbidrag fra Center for Pediatric Genomics hos CCHMC (til CY). Det var også delvis understøttet af NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) i fordøjelsessystemet Research Core Center i Cincinnati.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
