利用DNA染色体引发的侧群体表型，从生物样品中检测和纯化癌细胞
Summary
允许从生物样品中鉴定和分离干细胞群体的方法对于癌症及其以外的干细胞靶向治疗的进展至关重要。在这里，我们提供使用染料触发侧群体表型的癌症干细胞分离的详细方案。
Abstract
癌症是干细胞驱动的疾病，并且这些细胞的根除已成为主要的治疗目标。解密癌症干细胞（CSCs）的脆弱性和鉴定合适的分子靶标依赖于允许其在异种样品如细胞系和离体肿瘤组织中的特异性鉴别的方法。流式细胞术/ FACS是在单细胞水平上多参数解剖生物样品的强大技术，是迄今为止选择的方法，用于回收活细胞进行下游分析。表面标志物如CD44和CD133以及醛脱氢酶酶活性的检测常常用于通过FACS定义和分离来自肿瘤样品的CSCs。以方法学细节描述的补充方法利用ABC药物转运蛋白的功能性染料挤出，其识别通常称为侧群体（SP）的不同的荧光 – 细胞群体。 SP;癌细胞表现出典型的干细胞特征，并且可以使用抑制染料挤出药物转运蛋白（最常见的是ABCB1 / P-糖蛋白/ MDR1 / CD243和ABCG2 / Bcrp1 / CD338）的试剂来消除和功能确认。此外，SP测定与其他流式细胞术评估（如表面抗原染色，醛脱氢酶检测和死细胞鉴别（ 例如 ，使用7-AAD或碘化丙啶（PI））相容。因此，我们基于功能而不是表型参数，机械地描述了CSC识别，分离和子表征的有价值且广泛适用的方法。尽管最初以Hoechst 33342作为引发染料，但我们在此着重于在配备有紫色激光源的任何流式细胞仪上可分辨的最新的基于紫罗兰染料的SP表型。
Introduction
由于对该疾病的遗传和分子理解以及诸如治疗性抗体和小分子抑制剂等靶向药物的出现的引人注目的进展，原发性癌症疗法在过去十年中已经大大改善。相比之下，转移性和复发性疾病通常是不可治愈的，并且这些临床环境中的发病率和死亡率仍然很高。 CSCs在肿瘤内代表不同的亚群，并具有典型的干细胞特性，如克隆性/致瘤性，多药耐药和不对称细胞分裂1,2 。因此，CSCs不仅可以促进转移性进展和肿瘤异质性，而且在治疗期间也会持续使患者复发。因此，治疗性CSC消除是预防疾病复发并允许长期治愈癌症的重要医疗需要3 </suP>。
识别脆弱性和阐明消除CSCs的策略在很大程度上取决于允许从生物样品中纯化以进行后续表达谱和/或功能调查的方法。反过来，这些方法依赖于对这些细胞特异的表面，细胞内或功能性标记。 CSC特异性表面标志物包括但不限于CD44，CD133，CD24和CD90，并且已被用于鉴定多种肿瘤实体（包括乳腺癌和结肠癌）中的CSC群体。另一种标记物醛脱氢酶（ALDH）显示细胞内定位，并且可以在功能上检测到提供酶转化产生光的各自的底物。使用此测试，CSC群体也已被鉴定在不同的肿瘤实体5 。一种补充方法，通常称为SP分析，并在此处描绘方法学细节，利用ABC药物转运蛋白的活性染料流出来鉴定出少量的荧光样干细胞样细胞群6,7,8 。为了实现这一点，给定的样品在亲脂性DNA结合荧光团的存在下孵育，其通过被动扩散进入所有细胞并靶向用于结合的核和线粒体DNA。没有ABC药物转运蛋白表达的非CSCs累积染料，导致明亮的荧光，而CSCs主动挤出染料，减少荧光。药物转运蛋白活性的药理学抑制消除了功能上的SP表型，应用于控制目的。具有SP特征的CSC群体已经公开在卵巢癌9,10 ，前列腺癌11 ，> 12，乳腺癌13 ，肺癌14 ，子宫内膜癌15 ，胶质瘤16,17和骨肉瘤18 。重要的是，SP测定与癌细胞系和原发性肿瘤组织相容，即使主要材料构成额外的挑战，例如对特定肿瘤细胞鉴别策略的需求（某些宿主细胞群体也可表现出SP特征） 19,20 。
两种最成功的SP赋予药物转运蛋白是ABCB1 / P-糖蛋白/ MDR1 / CD243和ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8,9,21;然而，其他药物转运蛋白也可以是SP表型的分子决定因素（ 例如 ，ABCB5） 22 。 ABCB1可以有效地阻断维拉帕米，而ABCG2的活性可以用fumitremorgin C（FTC）6,19来明确消除。 SP分析的特殊强度是可以与其他染色（ 例如表面标志物和ALDH）组合，并且允许活细胞恢复，从而与下游功能调查相容。此外，由于CSC人群9,23中ABC药物转运蛋白的保护性高，所以SP检测广泛适用。
最初，使用Hoechst 33342作为触发染料24进行了SP检测。该染料具有优异的分辨率，但需要紫外激光激发;因此其适用性自然限于高端流式细胞仪器。 DyeCycle Violet（DCV） 25的出现开启了新的avenu用于SP分析，并将该方法扩展到缺乏紫外激光源（紫激光源足以解决DCV-SP细胞）的标准流式细胞仪器的适用性。重要的是，Hoechst 33342和DCV具有共同的泵特异性，表明染料应识别相同的细胞群体。
在这里，我们提供了基于DCV的SP分析的详细实验方案，以便在独立实验室中快速简便地再现。因此，我们认为我们的文章是CSC研究人员的资源，应该有助于这种有用的细胞生物学方法的优化和标准化。
Protocol
Representative Results
Discussion
癌症临床管理进展也取决于针对CSCs的治疗方式的发展。允许从生物样品中可靠分离CSCs的方法将加速鉴定合适的靶标，因此在这项工作中至关重要。 SP分析是确定表达ABC药物转运蛋白的CSC群体的确定和有价值的技术，并且DCV的实施已经将其适用性扩展到标准流式细胞仪器。在机理上，SP鉴别利用ABC药物转运蛋白的活性染料流出来检测基于低荧光的CSC，从而在图的底部留下相应的非SP的特征定位。重?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch由奥地利科学基金会FWF（授权号J-3807）的ErwinSchrödinger奖学金支持。
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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