Summary
Methoden die de karakterisering en isolatie van stamcellenpopulaties van biologische monsters mogelijk maken, zijn cruciaal voor het voorschot van stamcelgerichte behandelingen in kanker en daarbuiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor kanker stamcellenisolatie met behulp van het kleurstof geactiveerde zijpopulatie fenotype.
Abstract
Kanker is een stamcelgedreven ziekte en uitroeiing van deze cellen is een belangrijk therapeutisch doel geworden. Het ontcijferen van kwetsbaarheden van kankerstamcellen (CSC's) en het identificeren van geschikte moleculaire doelen berust op methoden die hun specifieke discriminatie in heterogene monsters toelaten, zoals cellijnen en ex vivo tumorweefsel. Flowcytometrie / FACS is een krachtige technologie om biologische monsters multi-parametrisch op het enkelcelniveau te dissecteren en is tot op heden de methode van keuze om levende cellen te herstellen voor downstream-analyses. Oppervlakte markers zoals CD44 en CD133 evenals detectie van aldehyde dehydrogenase enzymatische activiteit zijn vaak gebruikt om CSC's uit tumormonsters door FACS te definiëren en uit te sorteren. Een complementaire aanpak, die hier in het methodologisch detail wordt uitgebeeld, maakt gebruik van functionele kleurstofextrusie door ABC-geneesmiddeltransporteurs, die een duidelijke populatie van fluorescentiedimpers identificeren die gewoonlijk worden aangeduid als zijpopulatie (SP). SPKankercellen vertonen kanonieke stamcelkenmerken en kunnen worden opgeheven en functioneel bevestigd met behulp van middelen die de kleurstof-extruderende geneesmiddeltransporteur remmen (meestal ABCB1 / P-glycoproteïne / MDR1 / CD243 en ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Bovendien is de SP-analyse verenigbaar met andere stromingscytometrische evaluaties zoals het vlek van oppervlakteantigenen, detectie van aldehyde dehydrogenase en discriminatie van de doodcellen ( bijv . Met 7-AAD of propidiumjodide (PI)). Zo beschrijven we een waardevolle en breed toepasselijke methode voor CSC-identificatie, isolatie en subkarakterisering mechanistisch gebaseerd op een functionele, in plaats van een fenotypische parameter. Hoewel oorspronkelijk uitgevoerd met Hoechst 33342 als triggerende kleurstof, concentreren wij ons hier op het meer recente Violet-kleurstof-gebaseerde SP-fenotype dat oplosbaar is op elke stromingscytometer uitgerust met een violette laserbron.
Introduction
De werkzaamheid van primaire kankertherapieën is in het afgelopen decennium aanzienlijk verbeterd door dwingende vooruitgang in het genetische en moleculaire begrip van de ziekte en de komst van gerichte geneesmiddelen, zoals therapeutische antilichamen en kleine molecuul-remmers. Daarentegen is de metastatische en terugkerende ziekte nog steeds typisch ongeneesbaar, en de morbiditeit en sterfte blijven hoog in deze klinische instellingen. CSC's vertegenwoordigen een onderscheidende subpopulatie binnen tumoren en zijn voorzien van kanonieke stamcel eigenschappen zoals clonogeniciteit / tumorigeniciteit, resistentie tegen meerdere geneesmiddelen en asymmetrische celverdeling 1 , 2 . CSCs drijven dus niet alleen metastatische progressie en tumor heterogeniteit, maar blijven ook tijdens de behandeling de patiënt voorspellen om terug te keren. Therapeutische CSC-eliminatie is daarom een belangrijke medische noodzaak om ziekteherhaling te voorkomen en langdurige genezing van kanker 3 mogelijk te maken
Het identificeren van kwetsbaarheden en het ophelderen van strategieën om CSC's zwaar te elimineren hangt af van methoden die hun zuivering van biologische monsters toelaten voor latere expressieprofielen en / of functioneel onderzoek. Op hun beurt zijn dergelijke methoden gebaseerd op oppervlak-, intracellulaire of functionele markers die specifiek zijn voor deze cellen. CSC-specifieke oppervlakte markers omvatten, maar zijn niet beperkt tot, CD44, CD133, CD24 en CD90, en zijn gebruikt om CSC populaties te identificeren in een verscheidenheid aan tumorentiteiten waaronder borstkanker en dikke darmkanker 4 . Een andere marker, aldehyde dehydrogenase (ALDH), toont intracellulaire lokalisatie en kan functioneel gedetecteerd worden, waarbij een respectief substraat wordt verschaft waarvan de enzymatische omzetting licht produceert. Met behulp van deze test zijn CSC-populaties ook in diverse tumorentiteiten geïdentificeerd 5 . Een complementaire methode, vaak aangeduid als SP analyse en hier weergegeven in m Ethodologisch detail, maakt gebruik van actieve kleurstofuitstroming door ABC-geneesmiddeltransporteurs om kleine populaties van fluorescentiedimme stamachtige cellen 6 , 7 , 8 te identificeren. Om dit te bereiken wordt een gegeven monster geïncubeerd in aanwezigheid van een lipofiele DNA-bindende fluorofoor, die alle cellen binnentreedt via passieve diffusie en target nucleair en mitochondriaal DNA voor binding. Niet-CSC's zonder ABC-geneesmiddeltransportuitdrukking accumuleren de kleurstof die resulteert in heldere fluorescentie, terwijl CSC's de kleurstof actief extruderen die de fluorescentie vermindert. Farmacologische remming van geneesmiddeltransportactiviteiten schrapt en functioneert het SP-fenotype functioneel en moet gebruikt worden voor controledoeleinden. CSC populaties die SP kenmerken vertonen zijn onder meer beschreven in eierstokkanker 9 , 10 , prostaatkanker 11 ,> 12, borstkanker 13 , longkanker 14 , endometriumkanker 15 , glioma 16 , 17 en botssarcoom 18 . Belangrijk is dat de SP-analyse verenigbaar is met zowel kankercellijnen als primaire tumorweefsel, hoewel primaire materiaal aanvullende uitdagingen veroorzaakt, zoals de vereiste voor een specifieke tumorcel-discriminatiestrategie (bepaalde gastheercellenpopulaties kunnen ook SP-kenmerken vertonen) 19 , 20 .
De twee meest gevestigde SP-toedienende geneesmiddeltransporteurs zijn ABCB1 / P-glycoproteïne / MDR1 / CD243 en ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andere geneesmiddeltransporteurs kunnen echter ook een moleculaire determinant van het SP-fenotype zijn (bijvoorbeeld ABCB5) 22 . ABCB1Kan efficiënt geblokkeerd worden met verapamil, terwijl de activiteit van ABCG2 specifiek kan worden opgeheven met fumitremorgine C (FTC) 6 , 19 . Een specifieke kracht van SP-analyse is dat het kan worden gecombineerd met andere vlekken ( bijv. Oppervlakmarkers en ALDH) en dat het het mogelijk maakt om de celcellen te herstellen, zodat ze compatibel zijn met downstream functionele onderzoeken. Bovendien is SP detectie breed toepasbaar door het hoge behoud van ABC drugstransporteurs onder CSC populaties 9 , 23 .
Oorspronkelijk is SP detectie uitgevoerd met behulp van Hoechst 33342 als een triggerende kleurstof 24 . Deze kleurstof bereikt een uitstekende resolutie, maar vereist ultraviolette laser excitatie; Vandaar dat de toepasselijkheid daarvan uiteraard beperkt is tot high-end flowcytometrische instrumenten. De komst van DyeCycle Violet (DCV) 25 heeft nieuwe avenu geopendEs voor SP analyse en verlengde de toepasbaarheid van deze methode op standaard flow cytometrische instrumenten die geen ultraviolette laserbron hebben (een violette laserbron is voldoende om DCV-SP cellen op te lossen). Belangrijk is dat Hoechst 33342 en DCV gemeenschappelijke pompspecificiteiten delen, wat aangeeft dat ofwel kleurstof dezelfde celpopulaties moet identificeren.
Hier geven we een gedetailleerd experimenteel protocol van DCV-gebaseerde SP analyse voor snelle en eenvoudige weergave in onafhankelijke labs. Daarom zien we ons artikel als een bron voor CSC-onderzoekers die bijdragen aan de optimalisatie en standaardisatie van deze nuttige celbiologische methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol voldoet volledig aan de standaard richtlijnen van de institutionele ethische beoordeling. Als mens- of dierweefsel wordt onderzocht met behulp van het hier afgebeelde protocol, zijn onderzoekers verplicht goedkeuring te hebben van de desbetreffende review board van hun instelling of land.
Voorzichtigheid: Standaardvoorzorgsmaatregelen voor het veilig hanteren van biologische monsters gelden voor dit protocol. Dit omvat het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas en, indien mogelijk, het werk onder een bioveiligheidskast.
1. Bereiding van cellen
- Kanker cellijnen
- Cultuur een respectieve humane of muizenkanker cellijn bij 37 ° C in 10-30 ml geschikt medium ( bijv . RPMI 1640 aangevuld met 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamine en 1x penicilline / streptomycine) en oogst De cellen bij sub-confluency ( dat wil zeggen 70-90%) met behulp van digestie met 0,05% trypsine-EDTA of een andere de-attAchment procedure. Bepaal de celtelling en controleer op de levensvatbaarheid met behulp van een telkamer en trypan blauwkleuring. De fractie van levensvatbare cellen moet 85% overschrijden.
OPMERKING: Voorbeelden van menselijke kankercellijnen die SP-compartimenten bevatten, omvatten MCF7 / HTB-22 en SKBR3 / HTB-30 (borstkanker), A2780 en SKOV-3 / HTB-77 (eierstokkanker) en A549 (longkanker) 26 .
- Cultuur een respectieve humane of muizenkanker cellijn bij 37 ° C in 10-30 ml geschikt medium ( bijv . RPMI 1640 aangevuld met 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamine en 1x penicilline / streptomycine) en oogst De cellen bij sub-confluency ( dat wil zeggen 70-90%) met behulp van digestie met 0,05% trypsine-EDTA of een andere de-attAchment procedure. Bepaal de celtelling en controleer op de levensvatbaarheid met behulp van een telkamer en trypan blauwkleuring. De fractie van levensvatbare cellen moet 85% overschrijden.
- Ex vivo tumorweefsel
- Neem een nieuw chirurgisch tumormonster of alternatief, oogst tumorweefsel uit een transplanteerbaar of genetisch gemanipuleerd muis tumor model. Neem 200-1.000 mg weefsel en genereer een enkele cel suspensie door mechanische disaggregatie ( bijv . Met behulp van een schaar of een scalpel) en enzymatische spijsvertering ( bijv . Met behulp van een collagenase / dispase / DNase cocktail).
- Filter het monster door een 70 μm afscheidingsfilter. Bepaal de celtelling en controleer op de levensvatbaarheid met behulp van een telkamer en trypan blUe kleuring
OPMERKING: Digestiecocktails bevatten vaak 200 μg / ml collagenase P, 0,8 U / ml dispase en 25 μg / ml DNase I, en incubatietijden variëren van 20 tot 50 minuten. Ideaal gezien wordt weefselschakeling uitgevoerd volgens een protocol dat is geoptimaliseerd voor het weefsel dat onderzocht wordt 27 , 28 , 29 .
2. Test monsters
- Verstel de celconcentratie aan 1 x 10 6 cellen / ml in vers cultureel medium (een voedingsbevattende vehikel is belangrijk omdat kleurstof extrusie een actief energieverbruik is). Uiteindelijk, overstappen 1 ml monster naar een gewone flow cytometry / FACS ronde bodembuis (gemerkt 'test').
OPMERKING: Voor optimale resultaten kan het nodig zijn dat de celconcentratie getitreerd wordt (bijvoorbeeld 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 cellen / ml), maar een lagere celconcentratie algemeneLy geeft een hogere resolutie 19 . Alleen voor het sorteren van applicaties waar een maximum aantal SP cellen moet worden hersteld, wordt aanbevolen de celconcentratie te verhogen tot 1 x 107 cellen / ml. - Voeg 10 μM DCV toe aan het monster en meng goed, ofwel door zachte vortexing of resuspending voor 3-5x. Ga door naar remmingscontroles.
OPMERKING: Optimale resultaten kunnen afhankelijk zijn van titratie van de triggerende kleurstof (bijvoorbeeld 2,5; 5; 10; 20 μM), maar een hogere kleurstofconcentratie levert over het algemeen een hogere resolutie 19 op .
3. Remmen Controls
- Vervoer 250 μL van de kleurstofbevattende celsuspensie naar een nieuwe flow cytometry / FACS ronde bodembuis (gelabeld 'control'). Voeg 50 μM verapamil of 20 μM FTC toe en meng goed door pipettering.
OPMERKING: Verapamil en FTC zijn de meest bekende remmen voor SP-analyse, maar hebben verschillende effluxpompspecificatiesY: Verapamil remt verscheidene ABC drugstransporteurs waaronder ABCB1 en ABCB5, terwijl FTC specifiek is voor ABCG2 6 , 19 . Als de SP-status van een afzonderlijk monster onbekend is, wordt het daarom aanbevolen zowel verapamil als FTC in afzonderlijke buizen te gebruiken.
4. Staining
- Pak de 'test' en 'control'-buizen en inkijk ze gedurende 90 minuten bij 37 ° C in het donker, met een lichte roering om de 15 minuten. Het grootste deel van de kleurstofextrusie in SP-cellen zal zich voordoen binnen de eerste 45 minuten, maar de accumulatie van kleurstof in niet-SP-cellen (bijgedragen tot resolutie) is maximaal na 75-90 min. 19 .
- Nadat de vulling is voltooid, wassen de cellen in 3-4 ml ijskoud PBS en resuspendeer de pellet in een volume van 100 μL (PBS ook). Houd de cellen in het donker en koud op ijs, en ga verder met het vullen van extra markers. Alternatief, directe flow cytometrische ana uitvoerenlysis.
5. Costaining voor andere markers
- Voeg een gewenst paneel fluorochrome-geconjugeerde antilichamen toe aan de DCV-gekleurde cellen, meng goed en incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten bij 4 ° C in het donker. Was de cellen in 3 - 4 ml ijskoud PBS en ga door naar de doodcellen discriminatie.
OPMERKING: Antilichaamformaten die gemakkelijk compatibel zijn met DCV en feitelijk geen vergoeding vereisen, zijn PerCP of PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 en BV786 . Formaten die compatibel zijn met DCV, maar kunnen vergoeding vereisen, zijn FITC, Alexa Fluor 488, PE en BV650. Formaten die vrijwel niet compatibel zijn met DCV, omvatten BV421, V450 en V500. - Voeg 7-AAD (of PI) toe aan de DCV-gekleurde cellen bij de door de fabrikant aanbevolen concentratie en incubeer de monsters gedurende 5 - 10 minuten in het donker. Filter de monsters door 70 μm afsnijders en ga door naar de flow cytometrische analyse.
6. Flow Cytometrische Analyse
OPMERKING: Het is aan te bevelen om het betreffende stroomcytometrische instrument al tijdens het vlekproces aan te zetten, zodat alles is ingesteld zodra de monsters klaar zijn. Dit omvat ook standaard onderhoudsprocedures zoals systeem prestatie tracking en tank hervulling.
- Verkrijg de cellen op de flow cytometer en steek ze op een bivariate FSC / SSC puntplot (Figuur 1B). Uitsluitend dubbels en aggregaten uitsluiten door de verschillende signalen van FSC ( dwz lengte, breedte, gebied) te vergelijken (figuur 1C).
- Als er een dode celmerker is opgenomen, is de poort op de levensvatbare celfractie (bijvoorbeeld 7-AAD-negatief) ( Figuur 1D ). Visualiseer de levensvatbare singletcellen op een bivariate puntplot voor 'blauwe' en 'rode' DCV-uitstoot. Hiertoe dient u het 'blauwe' fluorescentie kanaal op de y-as (bijvoorbeeld 450/50) en de 'Rood 'fluorescentiekanaal op de x-as ( bijv . 525/50).
- Schakel beide kanalen om naar de lineaire modus en stel de detectorspanningen dienovereenkomstig aan, zodat de SP naar de zijkant van de grafiek in het onderste linkerkwadrant lokaliseert. Omgekeerd lokaliseert de non-SP naar het rechterbovenkwadrant van het plot dat de celcyclusverdeling (G1 en G2) weerspiegelt. Poort de SP en stop de overname ( Figuur 1E ).
OPMERKING: DCV-gedefinieerde SP-cellen kunnen worden gedetecteerd met behulp van flowcytometrische instrumenten uitgerust met een violette laser excitatiebron ( dwz een 405 nm laser lijn). Het is één specifiek van SP-analyse dat de uitgeloste fluorescentie wordt gemeten in de lineaire modus en in twee afzonderlijke kanalen die worden weergegeven op een bivariate puntplot. De 'blauwe' emissie van DCV wordt gemeten op ongeveer 450 nm ( bijv . Met een 450/40 standaardfilter) en de 'rode' emissie van DCV wordt gemeten op ongeveer 510 - 585 nm ( bijv . Met een 510/50, een 525/50 of een 585/15 filter) 19 . Vanwege de specifieke chemie van de analyse is de scheiding tussen SP en niet-SP cellen in het algemeen hoger in het 'rode' fluorescentie kanaal 19 .
- Laad de remmingscontrole (en) en haal de gegevens op. De SP-cellen zijn nu verdwenen of zijn aanzienlijk verminderd ( Figuur 1F ). Verfijn eventueel de SP-poort op basis van deze gegevens.
- Om de oppervlakkenmerkuitdrukking door SP-cellen te onderzoeken, laat de 'rode' fluorescentie van DCV op de x-as achter en laat een respectievelijk fluorescentiekanaal op de y-as zien in de logaritmische modus ( bijv . APC). Pas de detectorspanningen op elkaar aan en steek de fractie SP-cellen af die positief zijn voor de onderzochte markering (s) ( Figuur 1G ). Co-expressie van een bepaalde marker door SP-cellen geeft een respectievelijk signaal in het bovenste linkerkwadrant van de grafiek 30 .
- Noteer deData en / of de SP-cellen sorteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorzien is een representatieve SP analyse van A2780 cellen, een menselijke eierstokkankerlijn die eerder werd getoond om een SP te regelen voor minder dan 1% van cellen 9 . Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in RPMI 1640 aangevuld met 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamine en 1x penicilline / streptomycine en geoogst bij 85% confluentie onder toepassing van behandeling met 0,05% trypsine-EDTA. Cellen werden gewassen in PBS en gefiltreerd door middel van 70 μm afsnijders. De celtelling werd bepaald met behulp van een telkamer en trypan blauwkleuring en 1 x 106 cellen / ml (vers medium) werden gedurende 90 min bij 37 ° C in het donker gekleurd met 10 uM DCV. Tegelijkertijd werd een aliquot daarvan geïncubeerd in aanwezigheid van 20 μM FTC onder precies dezelfde omstandigheden. Cellen werden gewassen in 4 ml PBS en een APC-geconjugeerd antilichaam tegen ABCG2 werd toegevoegd aan de 'test'-buis bij een vooraf getitreerde concentratie. Na incubatieOp 25 minuten bij 4 ° C werden cellen gewassen in PBS en 7-AAD werd toegevoegd aan de etiket van dode cellen. Monsters werden op ijs gekoeld en geanalyseerd op een FACS-instrument. De afgebeelde gatingstrategie is min of meer universeel van toepassing op andere monsters, hoewel zeer heterogeen materiaal, zoals monsters uit weefselmonsters, pre-definitie van de doelcelfractie vereist door gebruik te maken van specifieke oppervlakmarkeringen (bijvoorbeeld EpCAM, CD45, CD31). De weergegeven resultaten zijn bedoeld als referentie voor DCV-gebaseerde SP detectie in andere laboratoria. De relatieve lokalisaties van de onderzochte celpopulaties zouden derhalve ruwweg vergelijkbaar zijn, maar zeker niet identiek aan die verkregen door andere onderzoekers met onafhankelijke biologische monsters.
Figuur 1: Workflow en representatieve resultaten. (A) Hoofdstroomdiagram voor SP detectie met behulp van DCV staining. Costaining voor extra markers is optioneel, maar de doodscriminaliteit wordt sterk aanbevolen. ( BG ) Representatieve SP analyse van A2780 menselijke eierstokkankercellen uitgevoerd op een FACS instrument. Cellen zijn afgesloten volgens FSC / SSC karakteristieken (B) en doubletten en aggregaten zijn uitgesloten door de verschillende parameters van FSC te vergelijken ( bijv . Hoogte en breedte) ( C ). Daarna worden gediscrimineerde doden door middel van gating op de 7-AAD-negatieve (of PI-negatieve) celfractie ( D ). Live enkele cellen worden vervolgens weergegeven op een lineaire bivariate puntplot voor blauwe en rode DCV-emissie en de SP (en de bijbehorende niet-SP) is gated ( E ). Dezelfde analyse wordt nu gedaan met een respectievelijke remmingsregeling (in dit geval werd FTC gebruikt), en dit zou tot bijna-volledige verdwijning van cellen binnen de SP-poort ( F ) moeten leiden. Tenslotte kan het geïdentificeerde SP nauwkeuriger worden gekenmerkt, bijvoorbeeld door ereHet remmen van de ABC-geneesmiddeltransporteur (en) die verantwoordelijk zou kunnen zijn voor kleurstofextrusie waardoor het SP-fenotype (in dit geval ABCG2, in lijn met FTC-gevoeligheid) wordt toegekend. ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldehyde dehydrogenase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vooruitgang in het klinisch beheer van kanker hangt ook af van de ontwikkeling van behandelingsmodaliteiten die CSC's richten. Methoden die een betrouwbare isolatie van CSC's uit biologische monsters mogelijk maken, zullen de identificatie van geschikte doelen versnellen en zijn daarom van essentieel belang bij deze poging. SP-analyse is een gevestigde en waardevolle techniek om CSC-populaties te identificeren die ABC-drugstransporteurs uitdrukken en de implementatie van DCV heeft haar toepasselijkheid uitgebreid tot standaard flowcytometrische instrumenten. Mechanisch speelt SP-discriminatie actieve kleurstofuitvloeiing door ABC-geneesmiddeltransporteurs om CSC's op te sporen op basis van lage fluorescentie, waarbij een karakteristieke lokalisatie aan de zijkant van de plotbodem links wordt gebracht aan de overeenkomstige niet-SP. Belangrijk is dat DCV-gebaseerde SP-detectie een robuuste en eenvoudige methode is, waarbij de meest kritische stappen zijn: (i) de bereiding van cellen (ii) het vlekproces (iii) de selectie van een geschikt inhibitorItor en (iv) de flow cytometrische analyse. Omdat kleurstof extrusie een actief energieverbruikend proces is, is het bijzonder relevant om te beginnen met een goede cel levensvatbaarheid; Alleen levensvatbare (drugtransporteur-expressie) cellen kunnen een SP produceren. Bovendien is het vaak zinvol om de verhouding tussen kleurstofconcentratie en celdichtheid te optimaliseren en daardoor de afscheiding van SP-cellen te verbeteren (op zijn beurt vereist dit titratie van zowel DCV als cellen). Een algemene regel is dat zowel een hogere kleurstofconcentratie als een lagere celconcentratie resulteren in verbeterde scheiding 19 . De sleutel tot een succesvol DCV-experiment is de functionele validatie van het SP met behulp van farmacologische remmers van ABC-geneesmiddeltransportactiviteit. Zoals eerder vermeld zijn verapamil en FTC een van de meest voorkomende remmers voor SP-analyse en hebben verschillende pompspecificiteiten (FTC is specifiek voor ABCG2, terwijl verapamil meerdere pompen remt). Voor monsters met onbekende SP-status wordt het dus aanbeveeld om beide te gebruikenRemmers in afzonderlijke buizen. Een andere optie is het gebruik van de reserpine 4 van de pan-ABC drugtransporter remmer. Echter, onderzoekers moeten zich ervan bewust zijn dat autofluorescentie van deze verbinding het DCV-signaal 19 kan beïnvloeden. Zodra de cellen geanalyseerd zijn voor blauwe en rode DCV-uitstoot, moeten de detectorspanningen zodanig worden aangepast dat beide populaties ( dwz SP en niet-SP) zichtbaar zijn met maximale scheiding. Als de foto vreemd lijkt, kan de logaritmische schaal de reden zijn waarom (in dit geval beide kanalen terugzetten naar de lineaire modus).
Het is ook belangrijk om op te merken dat de DCV-gebaseerde SP-analyse niet specifiek voor kanker is, noch is het oorspronkelijk ontwikkeld voor toepassing in de oncologie. In plaats daarvan is het specifiek voor ABC-drugstransporteurs, waardoor ook de detectie en isolatie van fysiologische (weefsel) stamcellen wordt vergemakkelijkt, zoals lineage - Sca-1 + c-kit +Hematopoietische stamcellen 25 . Daarnaast kunnen gedifferentieerde celtypes die speciale barrières oprichten op cruciale lichaamssites, ook SP kenmerken 20 tonen . Het toepassen van DCV-gebaseerde SP-detectie op primaire weefsels vereist daarom specifieke discriminatie van de doelcellenpopulatie met behulp van geschikte markers.
Gezien het hoge behoud van drugsuitstromingspompen onder CSC-populaties 9 , 23 is DCV-gebaseerde SP-detectie breed toepasbaar, een feit dat ook wordt geïllustreerd door het succesvolle gebruik ervan tegen tumorentiteiten inclusief entiteiten van verschillende kiemlaag oorsprong 9 , 17 , 18 . Andere voordelen zijn dat (i) cellen met directe implicaties bij resistentie van geneesmiddelen geïdentificeerd zijn (met name belangrijk voor de aanpak van klinisch relevante subcellen van kankercellen die mediating disease recurRence) en dat (ii) de detectie van een functionele, in plaats van een statische parameter, meer assays specificiteit kan geven en de resolutie 19 , 31 , 32 kunnen verbeteren. Uit de conceptuele / technologische kant is DCV-gebaseerde SP detectie duidelijk onderscheiden van antilichaam gemedieerde oppervlakkleuren: (i) De doelstructuur toont intracellulaire lokalisatie en vertegenwoordigt nucleïnezuur, niet eiwit. (Ii) De bepaling detecteert eiwitactiviteit, niet de blote aanwezigheid of dichtheid. (Iii) De doelcellen worden gedefinieerd op basis van lage fluorescentie, niet door een positief signaal. (Iv) Als een DNA-bindende kleurstof is DCV gevoelig voor zelfs geringe variaties in de cel- of kleurstofconcentratie tijdens kleuring 19 . (V) DCV fluorescentie wordt gemeten in de lineaire modus, niet logaritmisch. (Vi) DCV fluorescentie ( dwz de fluorescentie gegenereerd door een enkele fluorofoor) wordt gemeten in twee afzonderlijke kanalen, nOt in een enkele golflengte bereik. Ondanks deze specificaties is DCV-gebaseerde SP-analyse makkelijk te verrichten en blijkbaar verruimt de flow-cytometrische toolbox voor CSC-onderzoek.
DCV-gebaseerde SP analyse biedt ook veel mogelijkheden voor kostenbesparing voor andere markers, compatibel met beide conventionele antilichaam gemedieerde oppervlakkleuren (talrijke formaten mogelijk) en de commerciële test die ALDH enzymatische activiteit detecteert. We hebben hier echter gefocust op oppervlakkleuring en de lezer wordt verwezen naar gepubliceerde literatuur 4 om methodologische details te zien over de codetectie van ALDH-activiteit. In ieder geval moet DCV-geactiveerde SP-analyse gecombineerd worden met de doodcellen discriminatie en voor de hand liggende reagentia zijn 7-AAD en PI.
Opvallend, DCV-gedefinieerde SP-cellen (en niet-SP-controlecellen) kunnen live-gezuiverd worden met behulp van de sorteertoepassing van overeenkomstige flowcytometrische instrumenten. Omdat de SP-analyse een functionele pa detecteertRameter die alleen levensvatbare cellen kunnen produceren, kan de levensvatbaarheid van de herstelde SP-cellen over het algemeen hoog zijn (soms ongeveer 100%). Als er toch problemen met de levensvatbaarheid zouden zijn, kunnen verschillende technische parameters worden gecontroleerd, zoals de grootte van het sorteermondstuk, de aard van het buffermiddel en de temperatuur tijdens het sorteren (met behulp van een 70 μm mondstuk hebben we nooit problemen gehad met Levensvatbaarheid, maar een grotere mondstuk kan nog steeds helpen voor zeer delicate cellen). De herstelde cellen kunnen onderworpen worden aan stroomafwaartse analyses zoals qRT-PCR, Western blotting en global expression profiling ( bijv . Met behulp van gen array of de recentere RNASeq technologie). Voorts kunnen geïsoleerde SP-cellen worden onderzocht op functionele stamcelkarakteristieken ( bijv . Single-cell-clonogeniciteit en seriële transplantatie) of subculturen om cellijnen van verrijkte of zelfs pure SP-cellen te bepalen die voor maanden 9 stabiel zouden kunnen zijn. In onzeStudie, gebruikten we normale medium- en conventionele 2D-kunststofflessen naar DCV-gedefinieerde CSC's 9 , maar stamcelselectieve modaliteiten zoals ankeringsafhankelijke / 3D-cultuuromstandigheden en gespecialiseerde media zullen ook haalbaar zijn. Wij stellen voor dat de meest gunstige voorwaarden voor in vitro- uitbreiding van een bepaald SP compartiment individueel moeten worden gecontroleerd.
In samenvatting geven we hier de gedetailleerde experimentele workflow van CSC identificatie / isolatie aan door middel van DCV-gebaseerde SP analyse. Ons document zal CSC-onderzoekers helpen om deze nuttige methode in hun eigen laboratoria te implementeren en op te zetten, die de terapeutische anti-CSC-strategieën ter verbetering van het klinisch beheer van kanker verder moeten bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren. Er is ook geen betrokkenheid bij de voorbereiding van het manuscript.
Acknowledgments
Maximilian Boesch wordt ondersteund door een Erwin Schrödinger Fellowship van het Oostenrijkse Wetenschapsfonds FWF (subsidienummer J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
