Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas
Summary
Métodos que permiten la caracterización y el aislamiento de las poblaciones de células madre de muestras biológicas son fundamentales para el avance de los tratamientos dirigidos a células madre en el cáncer y más allá. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de células madre de cáncer utilizando el fenotipo de población lateral desencadenada por tinte.
Abstract
El cáncer es una enfermedad conducida por células madre y la erradicación de estas células se ha convertido en un objetivo terapéutico importante. La desciframización de las vulnerabilidades de las células madre de cáncer (CSC) y la identificación de objetivos moleculares adecuados se basa en métodos que permiten su discriminación específica en muestras heterogéneas tales como líneas celulares y tejido tumoral ex vivo . La citometría de flujo / FACS es una poderosa tecnología para diseccionar de forma multiparamétrica muestras biológicas a nivel de célula única y es hasta la fecha el método de elección para recuperar células vivas para análisis de aguas abajo. Los marcadores de superficie tales como CD44 y CD133, así como la detección de actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa, se han utilizado a menudo para definir y clasificar CSCs de muestras tumorales mediante FACS. Un enfoque complementario, descrito aquí en detalle metodológico, hace uso de la extrusión de colorante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica una población distinta de células fluorescentes-dim comúnmente denominadas población lateral (SP). SP, Las células cancerosas exhiben características de células madre canónicas y pueden ser anuladas y confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inhiben el transportador de fármacos extruyendo el colorante (más frecuentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Además, el ensayo de SP es compatible con otras evaluaciones de citometría de flujo tales como tinción de antígenos de superficie, detección de aldehído deshidrogenasa y discriminación de células muertas ( por ejemplo , con 7-AAD o yoduro de propidio (PI)). Por lo tanto, describimos un valioso y ampliamente aplicable método de CSC de identificación, aislamiento y sub-caracterización mecánica basada en un funcional, en lugar de un parámetro fenotípico. Aunque originalmente se realizó con Hoechst 33342 como colorante desencadenante, aquí nos centramos en el fenotipo más reciente basado en colorante Violeta SP que se puede resolver en cualquier citómetro de flujo equipado con una fuente de láser violeta.
Introduction
La eficacia de las terapias de cáncer primarias ha mejorado sustancialmente durante la última década debido a los avances en la comprensión genética y molecular de la enfermedad y el advenimiento de fármacos dirigidos como anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas. En contraste, la enfermedad metastásica y recurrente sigue siendo típicamente incurable, y la morbilidad y la mortalidad siguen siendo altos en estos ajustes clínicos. Las CSCs representan una subpoblación distinta dentro de los tumores y están dotadas de propiedades de células madre canónicas tales como clonogenicidad / tumorigenicidad, resistencia a múltiples fármacos y división celular asimétrica 1 , 2 . Por lo tanto, CSCs no sólo impulsan la progresión metastásica y la heterogeneidad tumoral, sino que también persisten durante el tratamiento para predisponer al paciente a la recaída. Por lo tanto, la eliminación terapéutica del CSC es una necesidad médica importante para prevenir la recurrencia de la enfermedad y permitir la curación a largo plazo del cáncer 3 </suP
La identificación de las vulnerabilidades y la elucidación de las estrategias para erradicar las CSC depende en gran medida de métodos que permitan su purificación a partir de muestras biológicas para su posterior perfilación y / o investigación funcional. A su vez, tales métodos se basan en marcadores superficiales, intracelulares o funcionales que son específicos para estas células. Los marcadores de superficie específicos de CSC incluyen, pero no se limitan a, CD44, CD133, CD24 y CD90, y se han usado para identificar poblaciones de CSC en una variedad de entidades tumorales incluyendo cáncer de mama y cáncer de colon 4 . Otro marcador, aldehido deshidrogenasa (ALDH), muestra localización intracelular y puede ser detectado funcionalmente proporcionando un sustrato respectivo cuya conversión enzimática produce luz. Usando esta prueba, las poblaciones CSC se han identificado en diversas entidades tumorales, así 5 . Un método complementario, comúnmente denominado análisis SP y retratado aquí en m Ethodological, aprovecha el eflujo de colorante activo por los transportadores de fármacos ABC para identificar pequeñas poblaciones de células de tallo fluorescente-dim-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir esto, se incuba una muestra dada en presencia de un fluoróforo de unión al ADN lipófilo que entra en todas las células a través de la difusión pasiva y se dirige al ADN nuclear y mitocondrial para la unión. Los no CSCs que carecen de expresión del transportador de fármacos ABC acumulan el colorante dando como resultado una fluorescencia brillante, mientras que CSCs extruyen activamente el colorante que reduce la fluorescencia. La inhibición farmacológica de la actividad transportadora de fármacos abroga y confirma funcionalmente el fenotipo SP y debe usarse para fines de control. Las poblaciones de CSC que presentan características de SP se han descrito, entre otros, en cáncer de ovario 9 , 10 , cáncer de próstata 11 ,> 12, cáncer de mama 13 , cáncer de pulmón 14 , cáncer endometrial 15 , glioma 16 , 17 y sarcoma óseo 18 . Es importante destacar que el ensayo SP es compatible con ambas líneas celulares de cáncer y tejido tumoral primario, aunque el material primario plantea retos adicionales tales como el requisito de una estrategia específica de discriminación de células tumorales (ciertas poblaciones de células huésped también pueden presentar características de SP) 19 , 20 .
Los dos transportadores de fármacos que confieren SP más establecidos son ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Sin embargo, otros transportadores de drogas puede ser un determinante molecular del fenotipo SP también ( por ejemplo , ABCB5) [ 22] . ABCB1Puede bloquearse eficazmente con verapamilo, mientras que la actividad de ABCG2 puede ser derogada específicamente con fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Una fuerza particular del análisis de SP es que puede combinarse con otras tinciones ( por ejemplo , marcadores de superficie y ALDH) y que permite la recuperación de células vivas siendo así compatible con investigaciones funcionales posteriores. Por otra parte, la detección de SP es ampliamente aplicable debido a la alta conservación de los transportadores de drogas ABC entre las poblaciones de CSC [ 9 , 23] .
Originalmente, la detección de SP se ha realizado utilizando Hoechst 33342 como un colorante desencadenante 24 . Este colorante consigue una excelente resolución pero requiere excitación con láser ultravioleta; Por lo tanto su aplicabilidad se limita naturalmente a los instrumentos de citometría de flujo de gama alta. La llegada de DyeCycle Violet (DCV) 25 ha abierto nuevas avenidasEs para el análisis SP y amplió la aplicabilidad de este método a los instrumentos de citometría de flujo estándar que carecen de una fuente láser ultravioleta (una fuente láser violeta es suficiente para resolver las células DCV-SP). Es importante destacar que Hoechst 33342 y DCV comparten especificidades comunes de la bomba, lo que indica que cualquier colorante debe identificar las mismas poblaciones de células.
Aquí, proporcionamos un protocolo experimental detallado del análisis de SP basado en DCV para una reproducción rápida y fácil en laboratorios independientes. Por lo tanto, percibimos nuestro artículo como un recurso para los investigadores de CSC que debería contribuir a la optimización y estandarización de este útil método biológico-celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El progreso en el manejo clínico del cáncer también depende del desarrollo de modalidades de tratamiento dirigidas a las CSC. Métodos que permiten el aislamiento fiable de CSC de muestras biológicas acelerará la identificación de objetivos adecuados y por lo tanto de importancia crítica en este esfuerzo. SP es una técnica establecida y valiosa para identificar las poblaciones de CSC que expresan los transportadores de fármacos ABC y la implementación del DCV ha extendido su aplicabilidad a los instrumentos es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch cuenta con el apoyo de una Beca Erwin Schrödinger del Fondo Austríaco de Ciencia FWF (concesión número J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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