Métodos que permiten la caracterización y el aislamiento de las poblaciones de células madre de muestras biológicas son fundamentales para el avance de los tratamientos dirigidos a células madre en el cáncer y más allá. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de células madre de cáncer utilizando el fenotipo de población lateral desencadenada por tinte.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer es una enfermedad conducida por células madre y la erradicación de estas células se ha convertido en un objetivo terapéutico importante. La desciframización de las vulnerabilidades de las células madre de cáncer (CSC) y la identificación de objetivos moleculares adecuados se basa en métodos que permiten su discriminación específica en muestras heterogéneas tales como líneas celulares y tejido tumoral ex vivo . La citometría de flujo / FACS es una poderosa tecnología para diseccionar de forma multiparamétrica muestras biológicas a nivel de célula única y es hasta la fecha el método de elección para recuperar células vivas para análisis de aguas abajo. Los marcadores de superficie tales como CD44 y CD133, así como la detección de actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa, se han utilizado a menudo para definir y clasificar CSCs de muestras tumorales mediante FACS. Un enfoque complementario, descrito aquí en detalle metodológico, hace uso de la extrusión de colorante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica una población distinta de células fluorescentes-dim comúnmente denominadas población lateral (SP). SP, Las células cancerosas exhiben características de células madre canónicas y pueden ser anuladas y confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inhiben el transportador de fármacos extruyendo el colorante (más frecuentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Además, el ensayo de SP es compatible con otras evaluaciones de citometría de flujo tales como tinción de antígenos de superficie, detección de aldehído deshidrogenasa y discriminación de células muertas ( por ejemplo , con 7-AAD o yoduro de propidio (PI)). Por lo tanto, describimos un valioso y ampliamente aplicable método de CSC de identificación, aislamiento y sub-caracterización mecánica basada en un funcional, en lugar de un parámetro fenotípico. Aunque originalmente se realizó con Hoechst 33342 como colorante desencadenante, aquí nos centramos en el fenotipo más reciente basado en colorante Violeta SP que se puede resolver en cualquier citómetro de flujo equipado con una fuente de láser violeta.
Introducción
La eficacia de las terapias de cáncer primarias ha mejorado sustancialmente durante la última década debido a los avances en la comprensión genética y molecular de la enfermedad y el advenimiento de fármacos dirigidos como anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas. En contraste, la enfermedad metastásica y recurrente sigue siendo típicamente incurable, y la morbilidad y la mortalidad siguen siendo altos en estos ajustes clínicos. Las CSCs representan una subpoblación distinta dentro de los tumores y están dotadas de propiedades de células madre canónicas tales como clonogenicidad / tumorigenicidad, resistencia a múltiples fármacos y división celula....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Este protocolo cumple con las directrices estándar de la Junta de Revisión Institucional de Ética. Si se investiga el tejido humano o animal usando el protocolo descrito aquí, los investigadores están obligados a obtener la aprobación de la junta de revisión de su institución o país.
Precaución: Las precauciones estándar para el manejo seguro de muestras biológicas se aplican a este protocolo. Esto incluye usar guantes y una bata de laboratorio, y realizar el trabajo bajo un gabinete de bioseguridad siempre que sea posible.
1. Preparación de células
- Líneas celulares de cáncer
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se proporciona un análisis SP representativo de células A2780, una línea celular de cáncer de ovario humano previamente mostrada para albergar un SP que representa menos del 1% de células 9 . Las células se cultivaron a 37ºC en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y 1 x penicilina / estreptomicina y se cosecharon al 85% de confluencia usando tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05%. Las células se lavaron en PBS y se filtraron a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El progreso en el manejo clínico del cáncer también depende del desarrollo de modalidades de tratamiento dirigidas a las CSC. Métodos que permiten el aislamiento fiable de CSC de muestras biológicas acelerará la identificación de objetivos adecuados y por lo tanto de importancia crítica en este esfuerzo. SP es una técnica establecida y valiosa para identificar las poblaciones de CSC que expresan los transportadores de fármacos ABC y la implementación del DCV ha extendido su aplicabilidad a los instrumentos estándar de c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés para declarar. Tampoco hay participación de ningún autor en la preparación del manuscrito.
Agradecimientos
Maximilian Boesch cuenta con el apoyo de una Beca Erwin Schrödinger del Fondo Austríaco de Ciencia FWF (concesión número J-3807).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Listo para usar |
| Clorhidrato de verapamilo | Sigma-Aldrich | V4629 | Disolver en etanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Disolver en DMSO |
| 7-AAD (o yoduro de propidio - PI) | BioLegend | 420403 | Listo para usar |
| Reactivos de cultivo celular estándar (p. ej., medio, FBS, L-glutamina, antibióticos, PBS, tripsina-EDTA, etc.) | Diferentes proveedores | ||
| Muestras/células de interés (p. ej., línea celular de cáncer humano o murino, tejido tumoral humano o murino) | Diferentes proveedores | ||
| Instrumento de citometría de flujo (FACS; analizador o clasificador de células) | Diferentes proveedores | Se requiere una fuente de láser | |
| violeta Tubos FACS (fondo redondo) | Diferentes proveedores | Tubos con tapa recomendados | |
| 70 y micro; Filtros de corte m | Diferentes proveedores | Opcional pero recomendado | |
| Mezcla de enzimas para la digestión (p. ej., colagenasa/dispasa/Dnasa) | Diferentes proveedores | Solo relevante para la disociación de tejidos | |
| Anticuerpos conjugados con flurocromo contra marcadores de superficie de interés | Diferentes proveedores | ||
| Kit ALDEFLUOR opcional Tecnologías | STEMCELL | 01700 | Opcional |
Referencias
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
