Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben
Summary
Methoden, die die Charakterisierung und Isolierung von Stammzellpopulationen aus biologischen Proben ermöglichen, sind entscheidend für den Fortschritt der Stammzell-zielgerichteten Behandlungen bei Krebs und darüber hinaus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Krebs-Stammzell-Isolierung mit dem Farbstoff-ausgelösten Seiten-Population Phänotyp.
Abstract
Krebs ist eine Stammzell-getriebene Krankheit und Tilgung dieser Zellen hat sich zu einem wichtigen therapeutischen Ziel. Die Entschlüsselung von Schwachstellen von Krebsstammzellen (CSC) und die Identifizierung geeigneter molekularer Targets beruht auf Methoden, die ihre spezifische Diskriminierung in heterogenen Proben wie Zelllinien und ex vivo- Tumorgewebe ermöglichen. Durchflusszytometrie / FACS ist eine leistungsstarke Technologie zur multiparametrischen Sezierung biologischer Proben auf Einzelzellenebene und ist bis heute die Methode der Wahl, um lebende Zellen für nachgeschaltete Analysen wiederherzustellen. Oberflächenmarker wie CD44 und CD133 sowie der Nachweis der enzymatischen Aldehyddehydrogenase wurden häufig verwendet, um CSCs aus Tumorproben durch FACS zu definieren und zu sortieren. Ein komplementärer Ansatz, der hier im methodischen Detail dargestellt ist, nutzt die funktionelle Farbstoff-Extrusion durch ABC-Arzneimitteltransporter, die eine ausgeprägte Population von fluoreszenzdämmenden Zellen identifiziert, die üblicherweise als Seitenpopulation (SP) bezeichnet werden. SPKrebszellen weisen kanonische Stammzellcharakteristiken auf und können unter Verwendung von Mitteln, die den Farbstoff-Extrudier-Arzneimitteltransporter hemmen (am häufigsten ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338), abrogiert und funktionell bestätigt werden. Darüber hinaus ist der SP-Assay mit anderen durchflusszytometrischen Auswertungen, wie Färbung von Oberflächenantigenen, Aldehyddehydrogenase-Nachweis und toter Zelldiskriminierung ( z. B. mit 7-AAD oder Propidiumiodid (PI)) kompatibel. So beschreiben wir eine wertvolle und weitgehend anwendbare Methode zur CSC-Identifikation, Isolierung und Subcharakterisierung mechanistisch auf der Grundlage eines funktionalen und nicht eines phänotypischen Parameters. Obwohl wir ursprünglich mit Hoechst 33342 als auslösenden Farbstoff durchgeführt wurden, konzentrieren wir uns hier auf den neueren violetten Farbstoff-basierten SP-Phänotyp, der auf jedem Durchflusszytometer, das mit einer violetten Laserquelle ausgestattet ist, auflösbar ist.
Introduction
Die Wirksamkeit der primären Krebstherapien hat sich im Laufe des letzten Jahrzehnts durch die überzeugenden Fortschritte im genetischen und molekularen Verständnis der Erkrankung und das Aufkommen von zielgerichteten Medikamenten wie therapeutischen Antikörpern und kleinen Molekülinhibitoren deutlich verbessert. Im Gegensatz dazu sind metastatische und wiederkehrende Erkrankungen immer noch typisch, und Morbidität und Mortalität bleiben in diesen klinischen Einstellungen hoch. CSCs stellen eine deutliche Subpopulation innerhalb von Tumoren dar und sind mit kanonischen Stammzelleneigenschaften wie Klonogenität / Tumorigenität, Multi-Arzneimittelresistenz und asymmetrischer Zellteilung 1 , 2 ausgestattet. So führen CSCs nicht nur metastatische Progression und Tumor Heterogenität, sondern auch bestehen während der Behandlung zu prädisponieren den Patienten zum Rückfall. Therapeutische CSC-Eliminierung ist daher ein wichtiges medizinisches Bedürfnis, die Wiederkehr von Krankheiten zu verhindern und eine langfristige Heilung von Krebs zu ermöglichen 3 </suP>.
Die Identifizierung von Schwachstellen und die Aufklärung von Strategien zur Beseitigung von CSCs hängt stark von Methoden ab, die ihre Reinigung aus biologischen Proben für die anschließende Expressionsprofilierung und / oder funktionelle Untersuchung ermöglichen. Im Gegenzug beruhen solche Verfahren auf Oberflächen-, intrazellulären oder funktionellen Markern, die für diese Zellen spezifisch sind. CSC-spezifische Oberflächenmarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CD44, CD133, CD24 und CD90 und wurden verwendet, um CSC-Populationen in einer Vielzahl von Tumorentitäten einschließlich Brustkrebs und Darmkrebs zu identifizieren 4 . Eine weitere Markierung, Aldehyddehydrogenase (ALDH), zeigt die intrazelluläre Lokalisierung und kann funktionell detektiert werden, wobei ein jeweiliges Substrat bereitgestellt wird, dessen enzymatische Umwandlung Licht erzeugt. Mit diesem Test wurden auch CSC-Populationen in diversen Tumorentitäten identifiziert. Eine ergänzende Methode, die gemeinhin als SP-Analyse bezeichnet und hier in m dargestellt wird Ethodologische Details, nutzt den aktiven Farbstoffausfluss durch ABC-Arzneimitteltransporter, um kleine Populationen von fluoreszenzdämmenden Stammzellen 6 , 7 , 8 zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird eine gegebene Probe in Gegenwart eines lipophilen DNA-bindenden Fluorophors inkubiert, der alle durch passive Diffusion in alle Zellen eindringt und nukleare und mitochondriale DNA zur Bindung zielt. Nicht-CSCs ohne ABC-Arzneimitteltransporter-Expression akkumulieren den Farbstoff, was zu einer hellen Fluoreszenz führt, während CSCs aktiv den Farbstoff extrudieren, der die Fluoreszenz reduziert. Die pharmakologische Hemmung der Arzneimitteltransporteraktivität unterbricht und verarbeitet den SP-Phänotyp funktionell und sollte für Kontrollzwecke verwendet werden. CSC-Populationen, die SP-Charakteristiken aufweisen, wurden unter anderem in Eierstockkrebs 9 , 10 , Prostatakrebs 11 ,> 12, Brustkrebs 13 , Lungenkrebs 14 , Endometriumkrebs 15 , Gliom 16 , 17 und Knochensarkom 18 . Wichtig ist, dass der SP-Assay sowohl mit Krebszelllinien als auch mit primärem Tumorgewebe kompatibel ist, obwohl das primäre Material zusätzliche Herausforderungen wie die Anforderung an eine spezifische Tumorzelldiskriminierungsstrategie darstellt (bestimmte Wirtszellpopulationen können auch SP-Merkmale aufweisen) 19 , 20 .
Die beiden am meisten etablierten SP-verleihenden Arzneimitteltransporter sind ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Jedoch können auch andere Arzneimitteltransporter eine molekulare Determinante des SP-Phänotyps sein ( zB ABCB5) 22 . ABCB1Kann mit Verapamil effizient blockiert werden, während die Aktivität von ABCG2 mit Fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 spezifisch aufgehoben werden kann. Eine besondere Stärke der SP-Analyse ist, dass sie mit anderen Färbungen ( z. B. Oberflächenmarkierungen und ALDH) kombiniert werden kann und dass es die lebende Zellwiederherstellung ermöglicht, so dass sie mit nachgeschalteten funktionellen Untersuchungen kompatibel ist. Darüber hinaus ist die SP-Erkennung aufgrund der hohen Konservierung von ABC-Arzneimitteltransportern unter den CSC-Populationen 9 , 23 weitgehend anwendbar.
Ursprünglich wurde die SP-Detektion unter Verwendung von Hoechst 33342 als Triggerfarbstoff 24 durchgeführt. Dieser Farbstoff erreicht eine ausgezeichnete Auflösung, erfordert jedoch eine Ultraviolettlaseranregung; Daher ist ihre Anwendbarkeit natürlich auf High-End-Durchflusszytometrie-Instrumente beschränkt. Das Aufkommen von DyeCycle Violet (DCV) 25 hat neue Avenu eröffnetEs für die SP-Analyse und erweitert die Anwendbarkeit dieser Methode auf Standard-Durchflusszytometrie-Instrumente ohne Ultraviolett-Laserquelle (eine violette Laserquelle genügt, um DCV-SP-Zellen zu lösen). Wichtig ist, dass Hoechst 33342 und DCV gemeinsame Pumpenspezifitäten aufweisen, was darauf hinweist, dass entweder Farbstoff die gleichen Zellpopulationen identifizieren sollte.
Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes experimentelles Protokoll der DCV-basierten SP-Analyse zur schnellen und einfachen Reproduktion in unabhängigen Labors zur Verfügung. So sehen wir unseren Artikel als Ressource für CSC-Forscher, die zur Optimierung und Standardisierung dieser nützlichen zellbiologischen Methode beitragen sollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Fortschritt in der klinischen Behandlung von Krebs hängt auch von der Entwicklung von Behandlungsmodalitäten ab, die auf CSCs abzielen. Methoden, die eine zuverlässige Isolierung von CSCs aus biologischen Proben ermöglichen, beschleunigen die Identifizierung geeigneter Ziele und sind daher in diesem Bestreben von entscheidender Bedeutung. SP-Analyse ist eine etablierte und wertvolle Technik zur Identifizierung von CSC-Populationen, die ABC-Drogen-Transporter ausdrücken und die Implementierung von DCV hat seine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch wird von einem Erwin Schrödinger Stipendium des Wissenschaftsfonds FWF (Stimmnummer J-3807) unterstützt.
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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