Metoder som möjliggör karakterisering och isolering av stamcellspopulationer från biologiska prover är avgörande för förskott av stamceller-riktade behandlingar i cancer och bortom. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering av cancerstamcellceller med användning av färgämneutlösad sidopopulation fenotyp.
Cancer är en stamcellsdriven sjukdom och utrotning av dessa celler har blivit ett viktigt terapeutiskt mål. Dekryptera sårbarheter hos cancerstamceller (CSC) och identifiera lämpliga molekylära mål är beroende av metoder som tillåter deras specifika diskriminering i heterogena prover såsom cellinjer och ex vivo tumörvävnad. Flödescytometri / FACS är en kraftfull teknik för att multi-parametriskt dissekera biologiska prover på encellsnivå och är hittills den metod som valts för att återställa levande celler för nedströmsanalyser. Ytmarkörer såsom CD44 och CD133 samt detektion av aldehyddehydrogenasens enzymatisk aktivitet har ofta använts för att definiera och sortera ut CSC från tumörprover av FACS. Ett komplementärt tillvägagångssätt, som beskrivs här i metodologisk detalj, utnyttjar funktionell färgämnekrossning av ABC-läkemedelstransportörer, som identifierar en distinkt population av fluorescensdimma celler som vanligtvis kallas sidopopulation (SP). SPCancerceller uppvisar kanoniska stamcellskarakteristika och kan upphävas och funktionellt bekräftas med användning av medel som hämmar färgämnextruderande läkemedelstransportören (oftast ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Vidare är SP-analysen kompatibel med andra flödescytometriska utvärderingar såsom färgning av ytantigener, aldehyddehydrogenasdetektering och dödcellsdiskriminering ( t.ex. med 7-AAD eller propidiumjodid (PI)). Således beskriver vi en värdefull och allmänt tillämplig metod för CSC-identifiering, isolering och delkarakterisering mekaniskt baserat på en funktionell, snarare än en fenotypisk parameter. Även om det ursprungligen utfördes med Hoechst 33342 som utlösande färgämne fokuserar vi här på den senaste Violet-färgbaserade SP-fenotypen som är lösbar på vilken flödescytometer som är utrustad med en violett laserkälla.
Effekten av primära cancerterapier har förbättrats väsentligt under det senaste decenniet på grund av tvingande framsteg i den genetiska och molekylära förståelsen av sjukdomen och tillkomsten av riktade läkemedel, såsom terapeutiska antikroppar och småmolekylhämmare. Däremot är metastatisk och återkommande sjukdom fortfarande vanligen oåterkalllig, och sjukligheten och dödligheten förblir höga i dessa kliniska inställningar. CSC: er representerar en distinkt subpopulation inom tumörer och är utrustade med kanoniska stamcellsegenskaper, såsom klonogenicitet / tumorigenicitet, resistens mot flera läkemedel och asymmetrisk celldelning 1 , 2 . Sålunda driver CSC inte bara metastatisk progression och tumör heterogenitet, men fortsätter även under behandling för att predisponera patienten att återfalla. Terapeutisk CSC-eliminering är därför ett viktigt medicinskt behov för att förhindra återkommande sjukdom och tillåta långvarig behandling av cancer 3 </sup>.
Identifiering av sårbarheter och belysande av strategier för att utplåna CSC: er kraftigt beror på metoder som tillåter deras rening från biologiska prover för efterföljande expressionsprofilering och / eller funktionell undersökning. I sin tur är sådana metoder beroende av yt-, intracellulära eller funktionella markörer som är specifika för dessa celler. CSC-specifika ytmarkörer inkluderar, men är inte begränsade till, CD44, CD133, CD24 och CD90 och har använts för att identifiera CSC-populationer i en mängd olika tumörenheter inklusive bröstcancer och koloncancer 4 . En annan markör, aldehyddehydrogenas (ALDH), visar intracellulär lokalisering och kan detekteras funktionellt, vilket ger ett respektive substrat, vars enzymatiska omvandling ger ljus. Med hjälp av detta test har CSC-populationer också identifierats i olika tumörenheter 5 . En komplementär metod som vanligen kallas SP-analys och porträttad här i m Etodologisk detalj, utnyttjar aktiv färgämneutflöde av ABC-läkemedelstransportörer för att identifiera små populationer av fluorescensdimma stamliknande celler 6 , 7 , 8 . För att uppnå detta inkuberas ett givet prov i närvaro av en lipofil DNA-bindande fluorofor som går in i alla celler genom passiv diffusion och inriktar kärn- och mitokondriellt DNA för bindning. Icke-CSCs som saknar ABC-läkemedelstransportörsuttryck ackumulerar färgämnet som resulterar i stark fluorescens, medan CSC: er aktivt extruderar färgämnet som reducerar fluorescens. Farmakologisk inhibering av läkemedelstransportaktivitet upphäver och funktionellt bekräftar SP-fenotypen och bör användas för kontrolländamål. CSC-populationer som uppvisar SP-egenskaper har blivit beskrivna bland annat i äggstockscancer 9 , 10 , prostatacancer 11 ,> 12, bröstcancer 13 , lungcancer 14 , endometriecancer 15 , gliom 16 , 17 och bensarkom 18 . Viktigt är att SP-analysen är kompatibel med både cancercellinjer och primärtumörvävnad, även om primärmaterialet utgör ytterligare utmaningar, såsom kravet på en specifik strategi för tumörcellsdiskriminering (vissa värdcellspopulationer kan också uppvisa SP-egenskaper) 19 , 20 .
De två mest etablerade SP-givande läkemedelstransportörerna är ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andra läkemedelstransportörer kan emellertid också vara en molekylär determinant av SP-fenotypen ( t.ex. ABCB5) 22 . ABCB1Kan effektivt blockeras med verapamil medan aktiviteten hos ABCG2 kan upphävas specifikt med fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . En särskild styrka för SP-analys är att den kan kombineras med andra färgämnen ( t.ex. ytmarkörer och ALDH) och att det möjliggör återställning av levande celler, vilket är förenligt med nedströms funktionella undersökningar. Dessutom är SP-detektering i stor utsträckning tillämplig på grund av den höga bevarande av ABC-läkemedelstransportörer bland CSC-populationer 9 , 23 .
Ursprungligen har SP-detektering utförts med användning av Hoechst 33342 som en utlösande färgämne 24 . Detta färgämne uppnår utmärkt upplösning men kräver ultraviolett laser excitation; Därför är dess tillämplighet naturligt begränsad till avancerade flödescytometriska instrument. Ankomsten av DyeCycle Violet (DCV) 25 har öppnat ny avenuEs för SP-analys och utvidgade tillämpligheten av denna metod till standardflödescytometriska instrument som saknar en ultraviolett laserkälla (en violett laserkälla är tillräcklig för att lösa DCV-SP-celler). Viktigt är att Hoechst 33342 och DCV delar gemensamma pumpspecifikationer, vilket indikerar att antingen färgämnen ska identifiera samma cellpopulationer.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat försöksprotokoll med DCV-baserad SP-analys för snabb och enkel reproduktion i oberoende laboratorier. Vi uppfattar sålunda vår artikel som en resurs för CSC-forskare som borde bidra till optimering och standardisering av denna användbara cellbiologiska metod.
Framsteg i klinisk hantering av cancer beror också på utvecklingen av behandlingsmodaliteter som riktar sig mot CSC. Metoder som möjliggör tillförlitlig isolering av CSC från biologiska prover kommer att påskynda identifieringen av lämpliga mål och är därför av avgörande betydelse i detta försök. SP-analys är en etablerad och värdefull teknik för att identifiera CSC-populationer som uttrycker ABC-läkemedelstransportörer och implementeringen av DCV har utökat användbarheten till standardflödescytom…
The authors have nothing to disclose.
Maximilian Boesch stöds av ett Erwin Schrödinger-stipendium från den österrikiska vetenskapsfonden FWF (bidragsnummer J-3807).
Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |