Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l'ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d'échantillons biologiques
Summary
Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.
Abstract
Le cancer est une maladie à base de cellules souches et l'éradication de ces cellules est devenue un objectif thérapeutique majeur. La déchiffrement des vulnérabilités des cellules souches cancéreuses (CSC) et l'identification de cibles moléculaires appropriées reposent sur des méthodes permettant leur discrimination spécifique dans des échantillons hétérogènes tels que les lignées cellulaires et le tissu tumoral ex vivo . La cytométrie de flux / FACS est une technologie puissante pour disséquer de manière paramétrique des échantillons biologiques au niveau de la cellule unique et date de la méthode de choix pour récupérer les cellules vivantes pour les analyses en aval. Les marqueurs de surface tels que CD44 et CD133 ainsi que la détection de l'activité enzymatique de l'aldéhyde déshydrogénase ont souvent été utilisés pour définir et trier les CSC à partir d'échantillons de tumeurs par FACS. Une approche complémentaire, illustrée ici en détail méthodologique, utilise l'extrusion fonctionnelle de colorant par les transporteurs de médicaments ABC, qui identifie une population distincte de cellules fluorescentes-dim communément appelées population latérale (SP). SP; Les cellules cancéreuses présentent des caractéristiques canoniques de cellules souches et peuvent être abrogées et confirmées fonctionnellement en utilisant des agents qui inhibent le transporteur de médicament extrudant de colorant (le plus souvent ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338). En outre, le test SP est compatible avec d'autres évaluations cytométriques en flux telles que la coloration des antigènes de surface, la détection des aldéhydes déshydrogénases et la discrimination des cellules mortes ( p. Ex . Avec 7-AAD ou iodure de propidium (PI)). Ainsi, nous décrivons une méthode valable et largement applicable pour l'identification, l'isolement et la sous-caractérisation CSC mécaniquement basée sur un paramètre fonctionnel, plutôt que phénotypique. Bien que, initialement, exécuté avec Hoechst 33342 en tant que colorant déclencheur, nous nous concentrons ici sur le phénotype SP Violet à base de colorant plus récent qui résolue sur tout cytomètre de flux équipé d'une source laser violette.
Introduction
L'efficacité des thérapies primaires contre le cancer s'est considérablement améliorée au cours de la dernière décennie en raison de progrès convaincants dans la compréhension génétique et moléculaire de la maladie et l'avènement de médicaments ciblés tels que les anticorps thérapeutiques et les inhibiteurs de petites molécules. En revanche, la maladie métastatique et récurrente est encore généralement incurable et la morbidité et la mortalité restent élevées dans ces milieux cliniques. Les CSC représentent une sous-population distincte dans les tumeurs et sont dotés de propriétés canoniques de cellules souches telles que la clonogénicité / tumorigénicité, la résistance aux médicaments multiples et la division cellulaire asymétrique 1 , 2 . Ainsi, les CSC non seulement entraînent une progression métastatique et une hétérogénéité des tumeurs, mais persistent également pendant le traitement pour prédisposer le patient à la rechute. L'élimination thérapeutique du SCC est donc un besoin médical important pour prévenir la récidive de la maladie et permettre un traitement à long terme du cancer 3 </suP>.
L'identification des vulnérabilités et l'élucidation des stratégies pour éradiquer les CSC dépend fortement des méthodes qui permettent leur purification à partir d'échantillons biologiques pour le profilage d'expression et / ou l'investigation fonctionnelle subséquente. À leur tour, de telles méthodes reposent sur des marqueurs de surface, intracellulaires ou fonctionnels spécifiques à ces cellules. Les marqueurs de surface spécifiques au CSC incluent, mais sans s'y limiter, CD44, CD133, CD24 et CD90, et ont été utilisés pour identifier les populations de CSC dans une variété d'entités tumorales, y compris le cancer du sein et le cancer du côlon 4 . Un autre marqueur, l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH), montre une localisation intracellulaire et peut être détecté fonctionnellement en fournissant un substrat respectif dont la conversion enzymatique produit de la lumière. En utilisant ce test, les populations du SCC ont également été identifiées dans diverses entités tumorales 5 . Une méthode complémentaire, communément appelée analyse SP et représentée ici en m Détail éthodologique, exploite l'efflux de colorant actif par les transporteurs de médicaments ABC pour identifier de petites populations de cellules fluorescentes de type tige faible 6 , 7 , 8 . Pour ce faire, un échantillon donné est incubé en présence d'un fluorophore lipophile qui lient de l'ADN qui pénètre dans toutes les cellules par diffusion passive et cible l'ADN nucléaire et mitochondrial pour la liaison. Les CSC non-dépourvus d'expression du transporteur de drogue ABC accumulent le colorant, ce qui entraîne une fluorescence brillante, tandis que les CSC extrudent activement le colorant qui réduit la fluorescence. L'inhibition pharmacologique de l'activité du transporteur de médicament abroge et confirme fonctionnellement le phénotype SP et doit être utilisée à des fins de contrôle. Les populations du CSC présentant des caractéristiques SP ont été révélées, entre autres, dans le cancer de l'ovaire 9 , 10 , le cancer de la prostate 11 ,> 12, cancer du sein 13 , cancer du poumon 14 , cancer de l'endomètre 15 , gliome 16 , 17 et sarcome de l'os 18 . Il est important de noter que le dosage SP est compatible avec les lignées cellulaires cancéreuses et les tissus tumoraux primaires, même si le matériau primaire pose des défis supplémentaires tels que l'exigence d'une stratégie spécifique de discrimination de cellules tumorales (certaines populations de cellules hôtes peuvent également présenter des caractéristiques de SP) 19 , 20 .
Les deux transporteurs de médicaments les plus reconnus sont les ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Cependant, d'autres transporteurs de médicaments peuvent également être un déterminant moléculaire du phénotype SP ( p. Ex . ABCB5) 22 . ABCB1Peut être bloqué efficacement avec le verapamil, alors que l'activité de l'ABCG2 peut être abrogée spécifiquement avec la fumétémorgin C (FTC) 6 , 19 . Une force particulière de l'analyse SP est qu'elle peut être combinée avec d'autres taches ( p. Ex. , Marqueurs de surface et ALDH) et qu'elle permet une récupération de cellules vivantes ainsi compatible avec les recherches fonctionnelles en aval. De plus, la détection de SP est largement applicable en raison de la grande conservation des transporteurs de médicaments ABC parmi les populations du SCC 9,23.
À l'origine, la détection de SP a été effectuée en utilisant le Hoechst 33342 comme colorant de déclenchement 24 . Ce colorant atteint une excellente résolution mais nécessite une excitation laser ultraviolet; De sorte que son applicabilité est naturellement limitée aux instruments cytométriques de flux haut de gamme. L'avènement de DyeCycle Violet (DCV) 25 a ouvert une nouvelle avenueEs pour l'analyse SP et a étendu l'applicabilité de cette méthode aux instruments cytométriques à flux standard dépourvus d'une source laser ultraviolette (une source laser violette suffit pour résoudre les cellules DCV-SP). Fait important, Hoechst 33342 et DCV partagent des spécificités communes de la pompe, indiquant que l'un ou l'autre colorant devrait identifier les mêmes populations de cellules.
Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé de l'analyse SP à base de DCV pour une reproduction rapide et facile dans les laboratoires indépendants. Nous percevons donc notre article comme une ressource pour les chercheurs du SCC qui devrait contribuer à l'optimisation et à la normalisation de cette méthode biologique cellulaire utile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès dans la gestion clinique du cancer dépendent également du développement de modalités de traitement ciblant les CSC. Les méthodes permettant l'isolement fiable des CSC à partir d'échantillons biologiques accéléreront l'identification des cibles appropriées et sont donc d'une importance cruciale dans cette entreprise. L'analyse SP est une technique établie et précieuse pour identifier les populations du SCC qui expriment les transporteurs de médicaments ABC et la mise en œuvr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch est soutenu par une bourse Erwin Schrödinger du FWF FTSA (numéro de délivrance J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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