रीयल-टाइम Iontophoresis Tetramethylammonium के साथ मात्रा मात्रा और ब्रेन एक्स्ट्रासेल्यूलर स्पेस के Tortuosity मात्रा
Summary
यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय आयनोपोथरेसिस का वर्णन करता है, एक ऐसा तरीका जो जीवित दिमाग के बाहरी स्थान (ईसीएस) के भौतिक मापदंडों को मापता है। ईसीएस में जारी एक निष्क्रिय अणु का प्रसार ईसीएस मात्रा अंश और कर्कत्व की गणना करने के लिए किया जाता है। मस्तिष्क ईसीएस में तीव्र प्रतिवर्ती परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए यह आदर्श है
Abstract
यह समीक्षा वास्तविक अवधारणाओं और प्रोटोकॉल का वास्तविक समय आयनोपोथोरिसिस (आरटीआई) पद्धति का प्रदर्शन करने का वर्णन करता है, जीने के मस्तिष्क के बाह्य स्थान (ईसीएस) का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सोने का मानक। ईसीएस सभी मस्तिष्क कोशिकाओं को घेरता है और इसमें अंतरीय द्रव और बाह्य मैट्रिक्स शामिल हैं। मस्तिष्क गतिविधि के लिए आवश्यक कई पदार्थों के परिवहन, जिनमें न्यूरोट्रांसमीटर, हार्मोन और पोषक तत्व शामिल हैं, ईसीएस के माध्यम से फैलता है। इस स्थान की मात्रा और ज्यामिति में परिवर्तन सामान्य मस्तिष्क प्रक्रियाओं के दौरान होते हैं, जैसे नींद और रोग संबंधी स्थितियों, जैसे आइस्केमिया। हालांकि, मस्तिष्क ईसीएस की संरचना और विनियमन, विशेष रूप से रोगग्रस्त राज्यों में, बड़े पैमाने पर बेरोज़गार बनी हुई है। आरटीआई विधि जीवित मस्तिष्क के दो भौतिक मापदंडों को मापता है: मात्रा अंश और कर्कत्व। वॉल्यूम अंश ईसीएस द्वारा नियंत्रित ऊतक मात्रा का अनुपात है। टर्टुओसिटी एक मस्तिष्क के माध्यम से फैलते समय रिश्तेदार बाधा का एक उपाय होती हैकोई अवरोध के साथ एक माध्यम की तुलना में Gion। आरटीआई में, एक निष्क्रिय अणु एक स्रोत माइक्रोइलेक्ट्रोड से मस्तिष्क ईसीएस में स्पंदित होता है। चूंकि अणु इस स्रोत से दूर होते हैं, आयन की बदलती एकाग्रता लगभग 100 माइक्रोन दूर स्थित एक आयन-चयनात्मक माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके समय से मापा जाता है। परिणामस्वरूप प्रसार वक्र से, दोनों मात्रा अंश और कर्कत्व की गणना की जा सकती है। इस तकनीक का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस में कई प्रजातियों (इंसानों सहित) और विवो में ईसीएस में तीव्र और पुरानी परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। अन्य तरीकों के विपरीत, आरटीआई का प्रयोग वास्तविक समय में मस्तिष्क ईसीएस में दोनों पलटवापसी और अपरिवर्तनीय परिवर्तनों की जांच के लिए किया जा सकता है।
Introduction
बाह्य अंतरिक्ष (ईसीएस) सभी मस्तिष्क कोशिकाओं के लिए बाहरी कनेक्शंस का नेटवर्क है और इसमें अंतरीय द्रव और बाह्य मैट्रिक्स ( चित्रा 1 ए और चित्रा 1 बी ) शामिल हैं। मस्तिष्क सेल फ़ंक्शन के लिए जरूरी कई पदार्थों का वितरण, जिसमें पोषक तत्व, हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर शामिल हैं, ईसीएस के माध्यम से फैलता है। वॉल्यूम, ज्यामिति और बाह्य मैट्रिक्स सहित इस अंतरिक्ष के भौतिक मापदंडों में परिवर्तन, ईसीएस और मस्तिष्क कोशिकाओं को स्नान करने वाले स्थानीय आयन सांद्रता के माध्यम से प्रसार को काफी प्रभावित कर सकते हैं, जिनका मस्तिष्क कोशिका समारोह 1 , 2 पर गहरा असर है।
मस्तिष्क क्षेत्र की दो संरचनात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए रीयल-टाइम आयनोपोरेसिस (आरटीआई) का उपयोग किया जाता है: मात्रा अंश और कर्कत्व 3 , 4 ,"Xref"> 5 वॉल्यूम अंश ( α ), कुल ऊतक मात्रा ( वी टिशू ) के सापेक्ष ईसीएस ( वी ईसीएस ) द्वारा एक प्रतिनिधि प्राथमिक मात्रा में पेश ऊतक मात्रा का अनुपात है;
Tortuosity ( λ ) रिश्तेदार बाधा है कि एक पदार्थ एक मस्तिष्क क्षेत्र के माध्यम से diffusing जब कोई अवरोधों के साथ एक माध्यम की तुलना में मुठभेड़;
जहां डी * (सेमी 2 एस -1 ) मस्तिष्क में पदार्थ का प्रभावी प्रसार गुणांक है और डी (सेमी 2 एस -1 ) एक नि: शुल्क माध्यम में निशुल्क प्रसार अंश है, जैसे पतला एगरोज़ जेल।
आज, आर के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला जांच पदार्थटीआई विधि छोटी सीेशन टेट्रामिथाइलमोनियम (टीएमए) है। टीएमए में 74 जी / एमओएल का एक आणविक वजन है, समाधान में पूरी तरह से पृथक होता है, और एक सकारात्मक चार्ज होता है। इस आयन के साथ आरटीआई के अध्ययन ने यह दर्शाया है कि α 
0.2 और λ 1.6 1 , 2 इसका मतलब यह है कि ईसीएस कुल मस्तिष्क की मात्रा का लगभग 20% है और यह कि एक छोटे, जड़ अणु का प्रसार ईसीएस में लगभग 2.5 गुना धीमी गति से होता है, कोई अवरोध नहीं 3 के माध्यम से। हालांकि, दोनों α और λ मस्तिष्क आयु, क्षेत्र और राज्य के साथ और रोग की स्थिति 1 में भिन्नता है। इन मापदंडों के परिवर्तन मस्तिष्क के विकास, बुढ़ापे, नींद, मिर्गी, और कई अन्य मौलिक प्रक्रियाओं और मस्तिष्क के रोगों से जुड़े हुए हैं 1, 6 जबकि अन्य तकनीकों का माप α और λ , आरटीआई, वास्तविक समय में रहने वाले ऊतकों के स्थानीय क्षेत्रों में दोनों को माप सकता है। इस कारण से, आरटीआई तीव्र और प्रतिवर्ती चुनौतियों के दौरान α और λ में बदलाव की जांच के लिए एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है।
आरटीआई का समर्थन करने वाले सिद्धांत को मूल रूप से निकोलसॉन और फिलिप्स द्वारा मान्यता दी गई थी, और इस तकनीक का उपयोग उस समय 4 , 7 से बड़े पैमाने पर किया गया है। आरटीआई का प्रयोग करने वाले प्रयोगों से आयनटोस्कोरोसिस द्वारा सोर्स माइक्रोइलेक्ट्रोड से टीएमए की एक नाड़ी को सोडियम एग्रोस जेल में रिलीज करने से शुरू होता है। एक बार बाहर निकल जाने पर, आयन स्वतंत्र रूप से यादृच्छिक पथों की संभावित अनंत संख्या ( चित्रा 1 डी ) से चुनकर, बिंदु स्रोत से दूर फैल जाते हैं। आयन की बदलती एकाग्रता समय-समय पर एक आयन-चयनात्मक माइक्रोइलेक्ट्रोड (आईएसएम) का उपयोग करके मापा जाता है100 माइक्रोन दूर ( चित्रा 1 सी ) टीएमए एकाग्रता में बदलाव गहरा रहे हैं और वक्र के लिए लगाए गए हैं जो डी के दोनों गणना और आयनोपोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के प्रोटोकॉल (प्रोटोकाल में चर्चा पैरामीटर) की संख्या के लिए अनुमति देता है। इन मूल्यों के साथ, डी * प्राप्त करने के लिए और α और λ दोनों की गणना करने के लिए ब्याज की एक मस्तिष्क क्षेत्र में प्रक्रिया को दोहराया जाता है। आयनोपोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड, डेटा संग्रह, रेखांकन और टीएमए एकाग्रता वक्र की फिटिंग का नियंत्रण और प्रयोगात्मक मापदंडों की गणना आम तौर पर वांडा और वाल्टर कार्यक्रमों द्वारा किया जाता है, जो कि इस उद्देश्य के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए हैं (सॉफ्टवेयर और उनके मैनुअल अनुरोध पर लेखकों से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है)।
इस समीक्षा के प्रोटोकॉल अनुभाग में सीआरटेंट मस्तिष्क स्लाइस में आरटीआई के डिजाइन और प्रदर्शन के लिए आवश्यक बुनियादी प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। तकनीक का उपयोग गैर-छड़ी में भी किया गया हैईएनटी मॉडल, मानव मस्तिष्क स्लाइस और विवो ब्रेन तैयारी 1, 4, 6, 8, 9 सहित। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग डेटा व्याख्या में बारीकियों को उजागर करने के लिए आदर्श और गैर-आदर्श परिणाम प्रदान करता है। अंत में, चर्चा अनुभाग संक्षेप में समस्या निवारण तकनीक, आरटीआई की सीमाएं, ईसीएस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली वैकल्पिक तकनीक और आरटीआई के भविष्य के अनुप्रयोगों को शामिल करता है।
चित्रा 1: ईसीएस के माध्यम से फैलाव के आरेख ( ए ) ईसीएस का आरेख: एक विशिष्ट मस्तिष्क खंड में ईसीएस का आकार और स्थान दर्शाता है। ग्रे मस्तिष्क सेल प्रक्रियाओं के बीच ईसीएस के निशान। ईसीएस का मात्रा कुल ऊतक मात्रा का लगभग 20% है ( यानी, मात्रा अंश = 02) शारीरिक शर्तों के तहत ( बी ) ईसीएस के बढ़ते आरेख: मस्तिष्क कोशिका ज्यामिति (ग्रे) और बाह्य मैट्रिक्स (बहुरंगी ग्लाइकोसमैनोग्लाइक्सेन और प्रोटियोग्लिककैन्स के जाल के रूप में चित्रित) सहित कठोरता के लिए योगदान देने वाले भौतिक मापदंडों को हाइलाइट करता है। ( सी ) बिन्दु स्रोत से प्रसार का 3 डी आरेख: एक आयनोपोरेरिक स्रोत से एक आईएसएम को निष्क्रिय अणुओं के शुद्ध आंदोलन को दर्शाता है। प्रसार बाधाओं और सेलुलर तेज को छोड़कर, अणु एक गोलाकार एकाग्रता मोर्चे के उत्पादन के सभी दिशाओं में बाहर फैल जाती है। आईएसएम आयनटॉपहायरेक्टिक स्रोत से जारी जड़ अणुओं की स्थानीय एकाग्रता को मात्रा देता है। ( डी ) मस्तिष्क के ईसीएस में प्रसार के कंप्यूटर सिमुलेशन: [फारसी बाईं] मोंटे कार्लो सिमुलेशन के लिए सेटअप; हरे रंग का क्षेत्र मस्तिष्क कोशिका प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं और लाल क्रॉस एक बिंदु स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। यह सेटअप मॉडल 1 ए चित्रा में मस्तिष्क के ऊतकों को चित्रित करता है। [मध्य चित्र] 3 और6 अणु यादृच्छिक आंदोलनों का प्रदर्शन करते हैं क्योंकि वे मस्तिष्क के बाह्य अंतरिक्ष के माध्यम से फैल जाते हैं, जो 2 आयाम में दिखाया गया है। [दूर सही] बिंदु स्रोत से कई अणुओं के यादृच्छिक चलता है। बिंदु स्रोत से सभी अणुओं का शुद्ध आंदोलन आकृति 1 सी में दर्शाया गया है। संचयी यादृच्छिक चलता कोशिकाओं के बीच के स्थान की रूपरेखा ( यानी, ईसीएस; आगे के स्पष्टीकरण के लिए संदर्भ 5 देखें) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Protocol
Representative Results
Discussion
चित्रा 10: गैर-आदर्श डेटा आम तकनीकी समस्याओं का प्रदर्शन ( ए ) iontophoresis माइक्रोएलेक्ट्रोड के साथ सामान्य तकनीकी मुद्दों के आरेख: तकनीकी मुद्दों का प्रदर्श…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम एनआईएच एनआईएनएनएस अनुदान R01 NS047557 द्वारा समर्थित किया गया था
Materials
| A/D and D/A converter | National Instruments Corporation | NI USB-6221 DAQ | The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available. |
| agarose | Lonza | NuSieve GTG Agarose #50081 | to prepare dilute agarose gel for RTI measurements |
| amplifier for ISM | Dagan | Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier | ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages |
| biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) | for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope | ||
| borosilicate theta capillary glass tubing | Harvard Apparatus | Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 | double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm |
| brush | Winsor & Newton | University Series 233, size 0 | round shoft handle brush, available from Amazon |
| bunsen burner | Fisher | ||
| camera for visualizing micropipettes | Olympus | OLY-150 | requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional |
| chart recorder | to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished | ||
| chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% | Sigma-Aldrich | catalog # 92360 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| Commercial Software | The MathWorks | MATLAB, Data acquisition toolbox | for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available. |
| eye protective goggles | Fisher | ||
| fixed-stage compound microscope | Olympus | BX51WI | can use other compound microscopes with fixed stages |
| forceps | Fine Science Tools | #11251-10 | to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work |
| fume hood | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab | ||
| glass microscope slide | Fisher | #12-550A | to chip microelectrode tips |
| heater/stirrer | Fisher | Corning PC-420D | to prepare dilute agarose gel and stir solutions |
| iontophoretic unit | Dagan | ION-100 and PS-100 | ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites) |
| liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium | World Precision Instruments | IE190 Potassium Ion Exchanger | Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight. |
| microelectrode holder | WPI | M3301EH | to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH. |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition |
| micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing |
| microprobe thermometer | Physiotemp | Model BAT-12R | fine probe of this thermometer is placed close to recording site |
| needle | BD | Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) | for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm) |
| objective 5x dry | Olympus | MPlan N | |
| objective 10x water immersion | Olympus | UMPlan FL N | 10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm |
| plastic containers (with lids) | Fisher | #14-375-148 | to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes |
| platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope | EXFO | Gibraltar Burleigh | platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability |
| porous minicup | for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade | ||
| reusable adhesive | Bostik | Blu-Tack | for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon |
| robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning | Sutter Instruments | MP-285 | two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text). |
| signal conditioning unit with low-pass filter | Axon Instruments | CyberAmp 320 or 380 | no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed. |
| silver wire | A-M Systems | #7830 | diameter 0.015", bare (no coating) |
| slice chamber | Harvard Apparatus | Warner Model RC-27L | this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber |
| stereomicroscope | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers | ||
| syringe, 10 mL | BD | Syringes and Needles #309604 | to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip |
| syringe filter 0.22µm pore | Whatman | #6780-1302 | to filter backfill solutions; available from Fisher |
| syringe needle, 28 gauge, 97mm | World Precision Instruments | MicroFil MF28G-5 | to backfill microelectrodes |
| Teflon (=PTFE) tubing | Component Supply | STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) | for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax. |
| temperature control system | Harvard Apparatus | Warner Models TC-344B and SH-27A | TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers |
| tetramethyammonium (TMA) chloride | Sigma-Aldrich | T-3411 | 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1000S | to cut brain slices |
| xylenes | Fisher | X5-1 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description |
References
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