Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

Summary

Este protocolo descreve a iontoforese em tempo real, um método que mede os parâmetros físicos do espaço extracelular (ECS) dos cérebros vivos. A difusão de uma molécula inerte liberada no ECS é utilizada para calcular a fração de volume ECS e tortuosidade. É ideal para estudar alterações reversíveis agudas na ECS cerebral.

Abstract

Esta revisão descreve os conceitos e protocolos básicos para executar o método de iontoforese em tempo real (RTI), o padrão-ouro para explorar e quantificar o espaço extracelular (ECS) do cérebro vivo. O ECS envolve todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular. O transporte de muitas substâncias necessárias para a atividade cerebral, incluindo neurotransmissores, hormônios e nutrientes, ocorre por meio da difusão através do ECS. Mudanças no volume e geometria deste espaço ocorrem durante processos cerebrais normais, como o sono e condições patológicas, como a isquemia. No entanto, a estrutura e a regulação das ECS cerebrais, particularmente em estados doentes, permanecem largamente inexploradas. O método RTI mede dois parâmetros físicos do cérebro vivo: fração volumétrica e tortuosidade. A fração de volume é a proporção de volume de tecido ocupado pela ECS. A tortuosidade é uma medida do impedimento relativo que uma substância encontra ao difundir através de um cérebro reEm comparação com um meio sem obstruções. Em RTI, uma molécula inerte é pulsada a partir de um microeletrodo de origem no ECS do cérebro. À medida que as moléculas se difundem para longe desta fonte, a mudança da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons, localizado a aproximadamente 100 um de distância. A partir da curva de difusão resultante, tanto a fração de volume quanto a tortuosidade podem ser calculadas. Esta técnica tem sido utilizada em fatias de cérebro de múltiplas espécies (incluindo seres humanos) e in vivo para estudar alterações agudas e crônicas para ECS. Ao contrário de outros métodos, RTI pode ser usado para examinar mudanças reversíveis e irreversíveis no ECS do cérebro em tempo real.

Introduction

O espaço extracelular (ECS) é a rede de canais interligados para todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular ( Figura 1a e Figura 1b ). A distribuição de muitas substâncias necessárias para a função das células cerebrais, incluindo nutrientes, hormônios e neurotransmissores, ocorre por difusão através da ECS. As mudanças nos parâmetros físicos deste espaço, incluindo o volume, a geometria e a matriz extracelular, podem afetar drasticamente a difusão através do ECS e as concentrações de íons locais que banham as células cerebrais, que têm um impacto profundo na função celular ^{1 , 2 do} cérebro.

A iontoforese em tempo real (RTI) é usada para determinar duas características estruturais de uma região do cérebro: fração volumétrica e tortuosidade ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. A fração de volume ( α ) é a proporção de volume de tecido ocupado pelo ECS ( V _ECS ) em relação ao volume total de tecido ( _tecido V ) em um volume elementar representativo;

A tortuosidade ( λ ) é o impedimento relativo que uma substância encontra quando se difunde através de uma região do cérebro em comparação com um meio sem obstruções;

Onde D ^* (cm ² s ^-1 ) é o coeficiente de difusão efetivo da substância no cérebro e D (cm ² s ^-1 ) é o coeficiente de difusão livre da substância em meio livre, como o gel de agarose diluído.

Hoje, a substância de sonda mais usada para o RO método TI é o pequeno catião tetrametilamônio (TMA). TMA tem um peso molecular de 74 g / mol, dissocia-se completamente em solução e tem uma carga positiva. Os estudos RTI com este íon demonstraram que α 0,2 e λ 1.6 ^{1 , 2} . Isso significa que o ECS é aproximadamente 20% do volume total do cérebro e que a difusão de uma molécula pequena e inerte ocorre aproximadamente 2,5 vezes mais devagar no ECS do que em um meio sem obstruções ³ . No entanto, tanto α como λ variam com a idade cerebral, região e estado e em condições patológicas ¹ . As alterações desses parâmetros foram ligadas ao desenvolvimento do cérebro, envelhecimento, sono, epilepsia e muitos outros processos e doenças fundamentais do cérebro ^{1, 6} . Enquanto outras técnicas medem α e λ , RTI pode medir tanto em regiões localizadas de tecido vivo em tempo real. Por esta razão, RTI tornou-se uma ferramenta indispensável para investigar as mudanças em α e λ durante os desafios agudos e reversíveis.

A teoria que suporta RTI foi originalmente validada por Nicholson e Phillips, e a técnica tem sido amplamente utilizada desde então ^{4 , 7} . As experiências que empregam RTI começam com a liberação de um pulso de TMA a partir de um microeletrodo de fonte por iontoforese em um gel de agarose diluído. Uma vez ejetados, os íons se difundem livremente da fonte pontual, escolhendo de um número potencialmente infinito de caminhos aleatórios ( Figura 1d ). A alteração da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons (ISM) posicionado aproximadamente100 um de distância ( Figura 1c ). As mudanças na concentração de TMA são graficadas e ajustadas a uma curva que permite o cálculo tanto de D como do número de transporte do microeletrodo de iontoforese (parâmetros discutidos no Protocolo). Com estes valores, o procedimento é repetido numa região cerebral de interesse para obter D ^* e calcular tanto α como λ . O controle do microeletrodo de iontoforese, a coleta de dados, a representação gráfica e o ajuste da curva de concentração de TMA e o cálculo dos parâmetros experimentais são tipicamente realizados pelos programas Wanda e Walter, que foram especificamente projetados para esse fim (o software e seus manuais são Livremente disponível dos autores mediante solicitação).

A seção de protocolo desta revisão descreve os procedimentos básicos necessários para projetar e executar RTI em fatias de cérebro de roedores. A técnica também foi usada em não-hasteent modelos, incluindo fatias de cérebro de humanos e em preparações in vivo cerebrais ^{1, 4, 6, 8, 9.} A seção Resultados representativos fornece resultados ideais e não ideais para destacar nuances na interpretação de dados. Finalmente, a seção de Discussão abrange brevemente as técnicas de solução de problemas, as limitações de RTI, as técnicas alternativas utilizadas para estudar o ECS e as futuras aplicações de RTI.

Figura 1: Diagramas de difusão através de ECS. (A) Diagrama de ECS: Demonstra o tamanho e localização do ECS em uma secção de cérebro normal. Amarelo marca o ECS entre os processos das células cerebrais cinzentas. O volume do ECS é aproximadamente 20% do volume total do tecido ( ou seja, fração volumétrica = 0.2) sob condições fisiológicas. ( B ) Diagrama ampliado do ECS: Destaca os parâmetros físicos que contribuem para a tortuosidade, incluindo a geometria das células cerebrais (cinza) e a matriz extracelular (diagrama como uma malha de glicosaminoglicanos e proteoglicanos multicoloridos). ( C ) Diagrama 3D de difusão a partir de uma fonte pontual: demonstra o movimento líquido de moléculas inertes de uma fonte iontoforética para um ISM. Excluindo barreiras de difusão e absorção celular, as moléculas se difundem para fora em todas as direções, produzindo uma frente de concentração esférica. O ISM quantifica a concentração local das moléculas inertes liberadas da fonte iontoforética. ( D ) Simulação computacional de difusão em ECS do cérebro: [Far left] Configuração para simulação de Monte Carlo; As esferas verdes representam processos de células cerebrais e a cruz vermelha representa uma fonte pontual. Esta configuração modela o tecido cerebral diagramado na Figura 1a . [Imagens do meio] 3 e6 moléculas que realizam movimentos aleatórios à medida que se difundem através do espaço extracelular do cérebro, mostrado em 2 dimensões. [Extremamente à direita] Caminhos aleatórios de muitas moléculas liberadas da fonte pontual. O movimento líquido de todas as moléculas da fonte pontual é para fora como descrito na Figura 1c . Os passeios aleatórios cumulativos descrevem os espaços entre as células ( ou seja, o ECS, veja a referência ⁵ para mais explicações). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos de animais, usados ​​para obter amostras de tecido, foram aprovados pelo comitê de ética animal no SUNY Downstate Medical Center. 1. Preparação de soluções e equipamentos Prepare uma solução de enchimento de NaCl 150 mM para o barril de referência do ISM. Armazene-o em uma seringa de 10 mL anexada a um filtro de 0,22 μm (para remover bactérias ou partículas). Prepare uma solução de aterramento de cloreto de TMA 150 mM (TMA-Cl) par…

Representative Results

A utilidade da técnica RTI é demonstrada em um experimento projetado para medir as mudanças em α e durante um desafio hipoosmolar ( Figura 8 e Figura 9 ). Já foi demonstrado que a redução da osmolaridade do ECS por lavagem na ACSF hipotônica produzirá uma diminuição em α e um aumento em λ 13 . Nesta exper…

Discussion

Figura 10: Dados não ideais que demonstram problemas técnicos comuns. (A) Diagramas de problemas técnicos comuns com microeletrodos de iontoforese: Comparação da versão normal do TMA de um microeletrodo funcionamento iontoforese com três fontes demonstrando questões técnicas. [Ampliação alta, a1] A corrente em uma fonte iontoforética ideal é carregada igualmente pela liberação de TMA…

Materials

A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)
objective 5x dry	Olympus	MPlan N
objective 10x water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description