Realtidsanalytik med tetrametylammonium för att kvantifiera volymfraktioner och tortuositet i hjärnens extracellulära utrymme

Summary

I detta protokoll beskrivs realtids-jontofores, en metod som mäter fysiska parametrar för det extracellulära utrymmet (ECS) av levande hjärnor. Spridningen av en inert molekyl som släpps ut i ECS används för att beräkna ECS-volymfraktionen och tortuositeten. Den är idealisk för att studera akuta reversibla förändringar i hjärnans ECS.

Abstract

Denna översikt beskriver de grundläggande begreppen och protokollet för att utföra den realtids jontoforesmetoden (RTI), guldstandarden för att utforska och kvantifiera den extracellulära rymden (ECS) hos den levande hjärnan. ECS omger alla hjärnceller och innehåller både interstitiell vätska och extracellulär matris. Transporten av många ämnen som krävs för hjärnaktivitet, inklusive neurotransmittorer, hormoner och näringsämnen, sker genom diffusion genom ECS. Förändringar i volymen och geometrin för detta utrymme uppträder under normala hjärnprocesser, som sömn och patologiska tillstånd, som ischemi. Strukturen och reglering av hjärnans ECS, i synnerhet i sjuka stater, förblir emellertid i stort sett oförskriven. RTI-metoden mäter två fysiska parametrar av levande hjärna: volymfraktion och tortuositet. Volymfraktion är andelen vävnadsvolym upptagen av ECS. Tortuosity är ett mått på det relativa hindret som ett ämne möter när det diffunderar genom hjärnans reGion jämfört med ett medium utan hinder. I RTI pulseras en inert molekyl från en källa-mikroelektrod till hjärnans ECS. När molekyler diffunderar bort från denna källa mäts den förändrade koncentrationen av jonen över tiden med användning av en jonselektiv mikroelektrode placerad ungefär 100 | im bort. Från den resulterande diffusionskurvan kan både volymfraktion och tortuositet beräknas. Denna teknik har använts i hjärnskivor från flera arter (inklusive människor) och in vivo för att studera akuta och kroniska förändringar i ECS. Till skillnad från andra metoder kan RTI användas för att undersöka både reversibla och irreversibla förändringar i hjärnans ECS i realtid.

Introduction

Det extracellulära utrymmet (ECS) är nätet av sammankopplade kanaler yttre till alla hjärnceller och innehåller både interstitiell vätska och extracellulär matris ( Figur 1a och Figur 1b ). Fördelningen av många ämnen som krävs för hjärncellsfunktionen, inklusive näringsämnen, hormoner och neurotransmittorer, uppträder genom diffusion genom ECS. Förändringar i de fysiska parametrarna för detta utrymme, inklusive volymen, geometrin och extracellulär matris, kan drastiskt påverka diffusion genom ECS och de lokala jonkoncentrationerna i bada hjärnceller som har en djupgående inverkan på hjärncellsfunktionen ^{1 , 2} .

Realtidsjontofores (RTI) används för att bestämma två strukturella egenskaper hos en hjärnområde: volymfraktion och tortuositet ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volymfraktion ( a ) är andelen vävnadsvolym upptaget av ECS ( V _ECS ) i förhållande till den totala vävnadsvolymen ( V- _vävnad ) i en representativ elementär volym;

Tortuosity ( λ ) är det relativa hindret att ett ämne möter när det diffunderar genom en hjärnområde jämfört med ett medium utan hinder.

Där D ^* (cm ² s ^-1 ) är substansens effektiva diffusionskoefficient i hjärnan och D (cm ² s ^-1 ) är substansens fria diffusionskoefficient i ett fritt medium, såsom utspädd agarosgel.

Idag är det mest använda probprovet för RTI-metoden är det lilla katjontetrametylammoniumet (TMA). TMA har en molekylvikt av 74 g / mol, dissocieras fullständigt i lösning och har en positiv laddning. RTI-studier med denna jon har visat att a 0,2 och λ 1,6 ^{1 , 2} . Det betyder att ECS är ungefär 20% av den totala hjärnvolymen och att diffusionen av en liten inert molekyl uppträder ungefär 2,5 gånger långsammare i ECS än i ett medium utan hinder ³ . Både α och λ varierar emellertid med hjärnålder, region och tillstånd och i patologiska förhållanden ¹ . Ändringar av dessa parametrar har kopplats till hjärnans utveckling, åldrande, sömn, epilepsi och många andra grundläggande processer och hjärnans sjukdomar ^{1, 6} . Medan andra tekniker mäter α och λ kan RTI mäta både i lokaliserade områden av levande vävnad i realtid. Av denna anledning har RTI blivit ett oumbärligt verktyg för att undersöka förändringar i a och λ under akuta och reversibla utmaningar.

Teorin som stödjer RTI validerades ursprungligen av Nicholson och Phillips, och tekniken har använts i stor utsträckning sedan den tiden ^{4 , 7} . Experiment som använder RTI börjar med frisättningen av en puls av TMA från en källa-mikroelektrod genom jontofores till en utspädd agarosgel. Därefter diffusioneras joner fritt från punktkällan och väljer från ett potentiellt oändligt antal slumpmässiga vägar ( Figur 1d ). Den förändrade koncentrationen av jon mäts över tiden med användning av en jon-selektiv mikroelektrode (ISM) placerad grovt100 μm borta ( Figur 1c ). Förändringarna i TMA-koncentrationen grafiseras och monteras på en kurva som möjliggör beräkning av både D och transportnivån för jontofores mikroelektroden (parametrar som diskuteras i protokollet). Med dessa värden upprepas proceduren i en hjärnregion av intresse för att erhålla D ^* och att beräkna både a och λ . Kontroll av jontofores mikroelektroden, datainsamling, grafning och montering av TMA-koncentrationskurvan och beräkning av försöksparametrarna görs vanligtvis av programmen Wanda och Walter, som har utformats speciellt för detta ändamål (programvaran och deras manualer är Fritt tillgänglig från författarna på begäran).

Protokolldelen i denna översikt beskriver de grundläggande procedurer som behövs för att designa och utföra RTI i hjärnskivor av gnagare. Tekniken har också använts i non-rodEnt-modeller, inklusive humana hjärnskivor och hjärnpreparat in vivo ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Avsnittet Representativa resultat ger både ideala och ideala resultat för att markera nyanser i datatolkning. Slutligen behandlar diskussionsdelen kortfattat felsökningstekniker, begränsningar av RTI, alternativa tekniker som används för att studera ECS och framtida tillämpningar av RTI.

Figur 1: Diagram över diffusion genom ECS. (A) Diagram av ECS: Visar på storleken och placeringen av ECS i en typisk hjärnsektion. Gul markerar ECS mellan de grå hjärncellsprocesserna. Volymen av ECS är ungefär 20% av den totala vävnadsvolymen ( dvs. volymfraktionen = 0.2) under fysiologiska förhållanden. B ) Förstorat diagram över ECS: Uppmärksammar fysiska parametrar som bidrar till tortuositet, inklusive hjärncellsgeometri (grå) och extracellulär matris (diagrammatiserat som ett nät av mångfärgade glykosaminoglykaner och proteoglykaner). ( C ) 3D-diagram över diffusion från en punktkälla: Demonterar nätrörelsen av inerta molekyler från en jontoforetisk källa till en ISM. Exklusive diffusionsbarriärer och cellupptagning diffunderar molekylerna utåt i alla riktningar och producerar en sfärisk koncentrationsfront. ISM kvantifierar den lokala koncentrationen av de inerta molekylerna som frigörs från den jontoforetiska källan. ( D ) Datorsimulering av diffusion i hjärnans ECS: [Längst till vänster] Inställning för Monte Carlo-simulering; Gröna sfärer representerar hjärncellsprocesser och det röda korset representerar en punktkälla. Denna inställning modellerar hjärnvävnaden som visas i figur 1a . [Mellanbilder] 3 och6 molekyler som utför slumpmässiga rörelser som de diffunderar genom hjärnans extracellulära utrymme, visas i 2 dimensioner. [Farst till höger] Slumpmässiga promenader av många molekyler släppta från punktkällan. Nettoförflyttningen av alla molekyler från punktkällan är utåt såsom avbildas i figur 1c . De kumulativa slumpmässiga promenaderna skisserar mellanrummen mellan cellerna ( dvs. ECS, se referens ⁵ för ytterligare förklaring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurprocedurer, som användes för att erhålla vävnadsprover, var godkännande av djuretikutskottet vid SUNY Downstate Medical Center. 1. Framställning av lösningar och utrustning Förbered en 150 mM NaCl-återfyllningslösning för ISM: s referensfat. Förvara den i en 10 ml spruta kopplad till ett 0,22 μm filter (för att avlägsna bakterier eller partiklar). Förbered en 150 mM TMA klorid (TMA-Cl) återfyllningslösning för mikroelektroderna. Förvara den i…

Representative Results

Användningen av RTI-tekniken demonstreras i ett experiment utformat för att mäta förändringarna i a och under en hypoosmolär utmaning ( Figur 8 och Figur 9 ). Det har tidigare visat sig att minskning av osmolariteten hos ECS genom tvättning på hypotonisk ACSF kommer att ge en minskning av a och en ökning av A 13 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page…

Discussion

Figur 10: Icke-idealiska data som visar gemensamma tekniska problem. (A) diagram av gemensamma tekniska problem med jontofores microelectrodes: Jämförelse av normal frisättning av TMA från en fungerande jontofores mikroelektrod med tre källor visar tekniska frågor. [Hög förstoring, a1] Strömmen i en ideell jontoforetisk källa bärs lika med TMA-frigöring och kloridupptagning. [Hög först…

Materials

A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate – do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5mm x 16mm)
objective 5x dry	Olympus	MPlan N
objective 10x water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10x objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description