在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9（AAV9）载体递送
Summary
本研究的目的是通过在成年小鼠中使用新的唾液基因传递技术来开发和验证脊髓腺相关病毒9（AAV9）介导的基因递送的效力和安全性。
Abstract
已经报道了在成年大鼠和猪中成功开发涎腺腺相关病毒9（AAV9）载体递送技术。已经证明使用低位放置的聚乙烯导管（PE-10或PE-5）用于AAV9递送，通过脊髓实质（白色和灰色物质）在低水平注射的脊髓节段中的有效转基因表达。由于神经变性疾病的转基因小鼠模型的广泛范围，强烈希望在成年小鼠中发展有效的中枢神经系统（CNS） – 靶向载体递送技术。因此，本研究描述了在成年C57BL / 6J小鼠中开发脊髓辅助载体递送装置和技术以允许安全和有效的脊髓AAV9递送。在脊髓固定和麻醉的小鼠中，使用XYZ操纵器用尖锐的34G针切开皮肤（颈部1和腰部1-2脊柱节段水平）。第二个XYZ马然后使用咬合器将平坦的36G针推进到腰部和/或颈部的腋下空间中。然后，首先注射编码绿色荧光蛋白（GFP）的AAV9载体（3-5μL; 1.2×10 13个基因组拷贝（gc））。注射后，定期评估神经功能（运动和感觉），动物在用4％多聚甲醛递送AAV9后14天灌注固定。水平或横向脊髓切片的分析显示在整个脊髓中的转基因表达，包括灰色和白色物质。此外，在运动皮层，细胞核和网状细胞的下降的运动轴突和神经元中观察到强烈的逆行介导的GFP表达。任何动物均未观察到神经功能障碍。这些数据表明，唾液腺向量传递技术可以成功地用于成年小鼠，而不会引起与程序相关的脊髓损伤，并且与高效转基因表达有关整个脊髓神经轴突。
Introduction
使用AAV载体治疗各种脊髓和CNS神经退行性疾病正在成为一个被广泛接受的平台，可有效地上调或沉默感兴趣的基因的表达。更有效地利用该技术治疗CNS /脊髓障碍的关键限制之一是将AAV载体递送到成年哺乳动物的深部脑或脊髓实质的能力有限。
据证实，例如，AAV9的成年啮齿动物，猫，或非人灵长类动物的全身性递送是在脑和脊髓1，2，3个神经元诱导转基因表达仅适度有效。 AAV9载体更有效的鞘内输送也已显示导致在解剖学定义的神经元池中只有有限的转基因表达。更具体地说，它已经是恶魔认为在非人灵长类动物，猪或啮齿动物中的顺式或骶 – 囊性鞘内AAV9传递导致脊髓α运动神经元和节段背根神经节神经元中高水平的转基因表达。然而，在脊柱的interneurons或升序或在白质下行轴突最小的或没有表达看到4个 ，5，6，7。总的来说，这些数据表明，存在高度有效的生物解剖屏障，其防止鞘内递送的AAV扩散进入更深的脊髓实质。
在以前使用成年大鼠和猪的研究中，开发了一种新型的唾液腺载体递送技术8 。使用这种方法，在单次推荐的subpial AAV9递送后证明了高效和多节段的转基因表达。一贯看到强烈的GFP表达在神经元，神经胶质细胞和下降/上升的轴突通过注射的脊髓段。这项研究首次表明，该皮肤表现出限制从鞘内空间扩散到脊髓实质的有效AAV9的主要障碍。虽然这种先前开发的技术和亚型注射装置相对容易在大型啮齿动物（如大鼠）或成年猪中使用，但该系统不适合用于小型动物，例如成年小鼠。由于各种神经变性疾病的可用转基因小鼠模型的数量很多，所以显然需要在小鼠中发展有效的脊髓实质载体递送技术。这种技术的可用性将允许研究特异性基因沉默（ 例如，使用shRNA）或使用细胞非特异性（ 例如巨细胞病毒-CNV或泛素）或细胞特异性（ 例如，突触素或胶质细胞）的上调的作用纤维酸性蛋白质（GFAP））启动子。
因此，在本研究中，我们开发和验证了一种可以有效地用于成年小鼠的微型载体递送系统。类似地，如在以前的大鼠和猪研究中，这项工作在小鼠中单次推注AAV9单次递送后，证明在整个脊髓实质中有力的转基因表达。这种方法的简单性，注射的小鼠对于亚临床AAV9递送的非常好的耐受性以及脊髓实质中转基因表达的高效力表明该技术可以在任何实验室设置中有效地实施并用于靶向脊髓基因表达的实验中。
Protocol
Representative Results
Discussion
目前的研究描述了一种在成年小鼠中的辅助载体（AAV9）递送技术。如所附视频所示，该方法和技术可以有效地被使用，只要根据既定和测试的规格，正确地制造所需的仪器和穿刺针和腋下注射针。
在小鼠中进行一致和安全的唾液注射的关键技术变量：
如所证明的，在背侧颈椎或腰椎板切除术后，可以在成年麻醉的小鼠中容易地进行支气管注射。有几个关键…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了SANPORC和ALSA基金会赠款（Martin Marsala）的支持。国家可持续发展计划，项目编号LO1609（捷克教育，青年和体育部）;和RVO：67985904（Stefan Juhas和Jana Juhasova）。
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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