Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos
Summary
O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.
Abstract
O desenvolvimento bem-sucedido de uma técnica de entrega do vetor de adeno-associado subpial 9 (AAV9) em ratos adultos e porcos foi relatado anteriormente. Utilizando cateteres de polietileno colocados subpialmente (PE-10 ou PE-5) para a entrega de AAV9, demonstrou-se uma expressão potente do transgene através do parênquima espinhal (substância branca e cinzenta) em segmentos espinhais injetados subpialmente. Devido à ampla gama de modelos de ratos transgênicos de doenças neurodegenerativas, há um forte desejo pelo desenvolvimento de uma técnica de entrega de vetor segmentado do sistema nervoso central potente (SNC) em camundongos adultos. Consequentemente, o presente estudo descreve o desenvolvimento de um dispositivo de entrega de vetor subpial da coluna vertebral e técnica para permitir a administração segura e eficaz de AAV9 espinhal em ratos C57BL / 6J adultos. Nos ratinhos imobilizados e anestesiados, o pia mater (nível cervical 1 e segmentar 1-2) foi inciso com uma agulha afiada de 34 G usando um manipulador XYZ. Um segundo XYZ maO nipulador foi então usado para avançar uma agulha 36G brusca no espaço subpial lombar e / ou cervical. O vetor AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 cópias do genoma (gc)) que codificam a proteína fluorescente verde (GFP) foi então injetado subpialmente. Após as injeções, a função neurológica (motor e sensorial) foi avaliada periodicamente, e os animais foram fixados por perfusão 14 dias após a administração de AAV9 com paraformaldeído a 4%. A análise das seções da corda espinal horizontal ou transversal mostrou expressão do transgene em toda a medula espinhal, tanto em matéria cinza quanto em substância branca. Além disso, observou-se uma intensa expressão de GFP mediada por retrogradabilidade nos axônios motores descendentes e nos neurônios no córtex motor, no núcleo e na formatio reticular. Não foi observada nenhuma disfunção neurológica em nenhum animal. Esses dados mostram que a técnica de entrega do vetor subpial pode ser usada com sucesso em camundongos adultos, sem causar lesão da medula espinhal relacionada ao procedimento, e está associada a expressões de transgênese altamente potentesDurante toda a neuraxis da coluna vertebral.
Introduction
O uso de vetores de AAV para tratar uma variedade de distúrbios neurodegenerativos da medula espinhal e do SNC está se tornando uma plataforma bem aceita para efetivamente aumentar ou silenciar a expressão dos genes de interesse. Uma das principais limitações para a utilização mais efetiva desta tecnologia para o tratamento de distúrbios do SNC / medula espinhal é a capacidade limitada de fornecer vetores AAV para o cérebro profundo ou parênquima da medula espinhal em mamíferos adultos.
Foi demonstrado, por exemplo, que a distribuição sistêmica de AAV9 em roedores adultos, gatos ou primatas não humanos é apenas moderadamente eficaz para induzir a expressão do transgene nos neurônios do cérebro e da medula espinhal 1 , 2 , 3 . A administração intratecal mais efetiva de vetores AAV9 também mostrou que leva a apenas expressão limitada de transgenes em conjuntos de neurônios anatomicamente definidos. Mais especificamente, tem sido demôniosQue o fornecimento de AAV9 intracelular cisterno ou lumbo-sacral em primatas, porcos ou roedores não humanos leva a um alto nível de expressão do transgene nos motoneurônios α da espinha e neurônios ganglionares da raça dorsal segmentar. No entanto, observa-se uma expressão mínima ou nenhuma em interneurônios espinhais ou axônios ascendentes ou descendentes na matéria branca 4 , 5 , 6 , 7 . Coletivamente, esses dados mostram que existe uma barreira biológico-anatômica altamente efetiva, o que impede a difusão do AAV entregue por via intratéfica no parênquima espinhal mais profundo.
Em um estudo anterior, utilizando ratos e porcos adultos, desenvolveu-se uma nova técnica de entrega de vetor subpial 8 . Ao usar essa abordagem, a expressão de transgene altamente potente e multi-segmentar foi demonstrada após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único. A expressão GFP intensa foi consistentemente vistaNos neurônios, células gliais e axônios descendentes / ascendentes através dos segmentos espinhais injetados. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a pia mater representa a barreira principal que limita a difusão efetiva de AAV9 no parênquima espinhal do espaço intratecal. Embora esta técnica previamente desenvolvida e o dispositivo de injeção subpial sejam relativamente fáceis de usar em roedores grandes (como ratos) ou porcos adultos, o sistema não é adequado para uso em animais pequenos, como ratos adultos. Devido ao elevado número de modelos de ratos transgênicos disponíveis de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos, existe uma necessidade clara de desenvolvimento de uma técnica efetiva de parto espinhal parenquimatoso em camundongos. A disponibilidade de tal técnica permitiria o estudo do efeito de silenciamento de genes específicos ( por exemplo, usando shRNA) ou upregulation usando células não específicas ( por exemplo, citomegalovírus-CMV ou Ubiquitin) ou específicas de células ( por exemplo, sinapsina ou glial Ácido fibrilarProteína (GFAP)) durante o desenvolvimento pós-natal inicial ou em condições doentes.
Conseqüentemente, no presente estudo, desenvolvemos e validamos um sistema de entrega de vetor subpial em miniatura que pode ser efetivamente usado em camundongos adultos. Da mesma forma, como em estudos anteriores de ratos e porcos, este trabalho demonstra uma expressão de transgênese potente ao longo do parênquima espinhal após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único em camundongos. A simplicidade desta abordagem, a tolerabilidade muito boa dos ratos injetados à entrega de AAV9 subpial e a alta potência da expressão do transgene no parênquima espinal sugerem que esta técnica pode efetivamente ser implementada em qualquer configuração de laboratório e utilizada em experimentos visando a expressão do gene espinhal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo descreve uma técnica de entrega de vector subpial (AAV9) em camundongos adultos. Conforme demonstrado no vídeo acompanhante, esta abordagem e técnica podem ser efetivamente utilizadas, desde que os instrumentos necessários e a agulha pia penetrante e a agulha de injeção subpial sejam devidamente fabricadas, de acordo com as especificações estabelecidas e testadas.
Variáveis técnicas críticas na realização de uma injeção subpial consistente e seg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela bolsa SANPORC e ALSA Foundation (Martin Marsala); Programa Nacional de Sustentabilidade, número de projeto LO1609 (Ministério da Educação, Juventude e Desporto); E RVO: 67985904 (Stefan Juhas e Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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