성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달
Summary
본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.
Abstract
성인 래트 및 돼지에서 아포 – 관련 바이러스 9 (AAV9) 벡터 전달 기술의 성공적 개발이 이전에보고되었다. AAV9 전달을 위해 subpially-placed 폴리에틸렌 카테터 (PE-10 또는 PE-5)를 사용하여, subpially-injection 척추 분절에서 척수 실질 (흰색 및 회색 물질)를 통한 강력한 형질 도입 유전자 발현이 입증되었습니다. 신경 퇴행성 질환의 광범위한 형질 전환 마우스 모델 때문에 성인 마우스에서 강력한 중추 신경계 (CNS) 표적화 된 벡터 전달 기술의 개발에 대한 강한 열망이 있습니다. 따라서, 본 연구는 성인 C57BL / 6J 마우스에서 안전하고 효과적인 척추 AAV9 전달을 허용하는 척추의 서브 벡터 전달 장치 및 기술의 개발을 기술한다. 척추 고정 및 마취 마우스에서, 피임 장치 (자궁 경부 1 및 척추 1-2 척수 분절 수준)를 XYZ 조작기를 사용하여 날카로운 34G 바늘로 절개 하였다. 두 번째 XYZ manipulator는 그 다음에 둔감한 36G 바늘을 요추 및 / 또는 자궁 경부 지방 공간으로 전진시키는 데 사용되었습니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 AAV9 벡터 (3-5 μL, 1.2 X 10 13 게놈 복사 (gc)) subpially 다음 주입되었다. 주사 후, 신경 학적 기능 (운동 및 감각)을 주기적으로 평가하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 AAV9 전달 후 동물을 관류 고정시켰다. 수평 또는 횡단 척수 절편의 분석은 회색 및 흰 물질 모두에서 전체 척수를 통한 전이 유전자 발현을 보였다. 또한, 심한 역행위 매개 GFP 발현은 운동 피질, 핵 ruber, 및 formio reticularis에 내림차순 모터 축삭과 뉴런에서 보였다. 어떤 동물에서도 신경 학적 장애는 관찰되지 않았다. 이 데이터는 대식 성 벡터 전달 기술이 프로 시저 관련 척수 손상을 일으키지 않으면 서 성숙한 생쥐에서 성공적으로 사용될 수 있고 매우 강력한 전이 유전자 발현과 관련이 있음을 보여줍니다척추 신경근을 통한 시온.
Introduction
다양한 척수 및 CNS 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 AAV 벡터의 사용은 관심 유전자의 발현을 효과적으로 상향 조절하거나 침묵시키는 잘 받아 들여지는 플랫폼이되고있다. CNS / 척수 장애를 치료하기위한이 기술의보다 효과적인 활용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 성인 포유류의 심부 뇌 또는 척수 실질에 AAV 벡터를 전달하는 능력이 제한적이라는 것입니다.
그것은 성인 쥐, 고양이, 또는 인간이 아닌 영장류에서 AAV9의 전신 배달 뇌와 척수 1, 2, 3의 신경 세포에서 유전자의 발현을 유도에서만 적당히 효과가 있음을 예를 들어 설명되었다. 해부학 적으로 정의 된 뉴런 풀에서 제한된 도입 유전자 발현만을 유도하는 것으로 AAV9 벡터의보다 효과적인 척수강 내 전달이 또한 나타났다. 더 구체적으로, 그것은 악마들이었습니다.비인간 영장류, 돼지 또는 설치류에서 cisternal 또는 lumbo-sacral intrathecal AAV9 전달이 척수 α 운동 신경 세포 및 분절 지느러미 뿌리 신경절 뉴런에서 높은 수준의 전이 유전자 발현을 유도한다. 그러나 척추 신경 계통 또는 백질의 오름차순 또는 내림차순 축삭에서는 최소한 또는 전혀 발현이 4 , 5 , 6 , 7로 나타난다. 종합적으로, 이러한 데이터는 매우 효과적인 생물학적 – 해부학 적 장벽이 존재한다는 것을 보여 주며, 척수 내에서 전달 된 AAV가 더 깊은 척추 실질로 확산되는 것을 방지합니다.
성인 쥐와 돼지를 사용하여 이전 연구에서 새로운 subpial 벡터 전달 기술은 8 개발되었다. 이 접근법을 사용하여 single-bolus subpial AAV9 전달 후 매우 강력하고 다 분절 형질 전환 유전자 발현이 입증되었습니다. 강렬한 GFP 발현이 지속적으로 나타남교감 신경절 세포, 신경 교세포, 하강 / 상행 축삭에서 주입 된 척추 분절을 통해 관찰되었다. 이 연구는 피 아게트가 척수 실질 내로의 효과적인 AAV9 확산을 막을 수있는 주요 장벽임을 나타냈다. 이 이전에 개발 된 기술과 subpial 주입 장치는 대형 설치류 (쥐와 같은) 또는 성인 돼지에서 비교적 사용하기 쉽지만,이 시스템은 성인 마우스와 같은 작은 동물에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 다양한 신경 퇴행성 장애의 이용 가능한 트랜스 제닉 마우스 모델이 매우 많기 때문에, 마우스에서 효과적인 척추 – 실질 세포 전달 기술의 개발이 분명한 필요성이있다. 이러한 기술의 이용 가능성은 세포 비 특이성 ( 예, 사이토 메갈로 바이러스 -MVV 또는 유비퀴틴) 또는 세포 특이 적 ( 예, 시냅스 또는 글라 이알)을 사용하는 특정 유전자 사일런 싱 ( 예 : shRNA 사용) 또는 상향 조절의 효과를 연구 할 수있다 섬유 성 산성단백질 (GFAP)) 프로모터를 포함한다.
따라서, 현재 연구에서, 우리는 성인 생쥐에서 효과적으로 사용할 수있는 소형 subpial 벡터 전달 시스템을 개발하고 검증했다. 유사하게, 이전의 쥐 및 돼지 연구에서와 마찬가지로,이 연구는 쥐에서 단일 – 볼 러스 서브 피알 AAV9 전달 후 척수 실질 전반에 걸쳐 강력한 전이 유전자 발현을 입증한다. 이 접근법의 단순성, subpial AAV9 전달에 주입 된 마우스의 아주 좋은 내성 및 척수 실질에서의 형질 전환 유전자 발현의 높은 효능은이 기술이 실험실 환경에서 효과적으로 수행되고 척추 유전자 발현을 목표로하는 실험에 사용됨을 시사한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이번 연구는 성체 마우스에서 subpial vector (AAV9) 전달 기술에 대해 설명합니다. 첨부 된 비디오에서 설명한 바와 같이,이 접근법과 기술은 필요한 장비와 피어 – 침투 바늘 및 서브 피알 주사 바늘이 적절하게 제조되고 제조되고 테스트 된 사양에 따라 제공되는 경우 효과적으로 사용할 수 있습니다.
생쥐에서 일관되고 안전하게 자궁 내 주사를 시행 할 때의 중요한 기술?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 SANPORC 및 ALSA 재단 보조금 (Martin Marsala)에 의해 지원되었습니다. 국가 지속 가능성 프로그램, 프로젝트 번호 LO1609 (체코 교육 청소년 스포츠부); 및 RVO : 67985904 (Stefan Juhas 및 Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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