उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी
Summary
वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य प्रौढ़ चूहों में एक उपन्यास उप-जीन डिलीवरी तकनीक का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में एनोनो-जुड़े वायरस 9 (एएवी 9) -विभागीय जीन डिलीवरी की क्षमता और सुरक्षा को विकसित और मान्य करना था।
Abstract
वयस्क चूहों और सूअरों में एक उप-शासक एडीनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वेक्टर डिलीवरी तकनीक का सफल विकास पहले ही दर्ज किया गया है। एएवी 9 वितरण के लिए उप-आधारित पॉलीथीन कैथेटर्स (पीई -10 या पीई -5) का प्रयोग करना, उप-इंजेक्शन वाले रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों में रीढ़ की हड्डी के पैरेन्काइमा (सफेद और ग्रे पदार्थ) के माध्यम से शक्तिशाली ट्रांसजेन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है। Neurodegenerative रोगों के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण, एक शक्तिशाली केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास के लिए एक मजबूत इच्छा है- प्रौढ़ चूहों में लक्षित वेक्टर वितरण तकनीक तदनुसार, वर्तमान अध्ययन में वयस्क C57BL / 6J चूहों में सुरक्षित और प्रभावी रीढ़ की हड्डी एएवी 9 डिलीवरी की अनुमति देने के लिए रीढ़ की हड्डी वाले उप-वैक्टर डिलीवरी डिवाइस और तकनीक के विकास का वर्णन किया गया है। मस्तिष्क में स्थिर और संवेदनाहारी चूहों में, पिया मेटर (गर्भाशय ग्रीवा 1 और कांच का 1-2 रीढ़ की हड्डी का स्तर) एक एक्सवाईजेड मैनिपुलेटर का उपयोग करके तेज 34 जी सुई के साथ छेड़ दिया गया था। एक दूसरा XYZ मानिपल्यूलर का उपयोग तो काठ और / या ग्रीवा उप-स्थान में एक कुंद 36 जी सुई को आगे बढ़ाने के लिए किया जाता था। एएवी 9 वेक्टर (3-5 μL; 1.2 x 10 13 जीनोम प्रतियां (जीसी)) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग (जीएफपी) को तब उप-आंशिक रूप से अंतःक्षिप्त किया गया था। इंजेक्शन के बाद, न्यूरोलॉजिकल फंक्शन (मोटर और संवेदी) का समय-समय पर मूल्यांकन किया गया था, और एआरएवी डिलीवरी के 4 दिनों के पैराफॉर्मालाइहाइड के साथ 14 दिनों के बाद जानवरों को छिड़काव का निर्धारण किया गया था। क्षैतिज या अनुप्रस्थ रीढ़ की हड्डी के खंडों का विश्लेषण पूरे रीढ़ की हड्डी में, ग्रे और सफेद पदार्थ दोनों में, ट्रांसजीने अभिव्यक्ति दिखाया। इसके अलावा, तीव्र रेटाग्राइड-मध्यस्थता वाली जीएफपी अभिव्यक्ति मोटर कार्टेक्स, न्यूक्लियस रूबर में अवरोही मोटर एक्सॉन और न्यूरॉन्स में देखी गई थी, और फॉर्मेटियो रिकिक्युलरिस। किसी भी जानवरों में कोई न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन नहीं देखा गया था। ये आंकड़े बताते हैं कि उपशीर्षक वेक्टर डिलीवरी तकनीक सफलतापूर्वक वयस्क चूहों में इस्तेमाल कर सकती है, बिना किसी प्रक्रिया से संबंधित रीढ़ की हड्डी की चोट के कारण, और अत्यधिक शक्तिशाली ट्रांसजीने एक्सप्रेशनरीढ़ की हड्डी में न्यूरैक्सिस
Introduction
विभिन्न प्रकार की रीढ़ की हड्डी और सीएनएस न्यूरोड-जेनरेटिव विकारों के इलाज के लिए एएवी वैक्टरों का इस्तेमाल ब्याज की जीन (जी) की अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से अपग्रेड करने या चुप्पी देने के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकृत मंच बन रहा है। सीएनएस / रीढ़ की हड्डी के विकारों के इलाज के लिए इस तकनीक के अधिक प्रभावी उपयोग की प्रमुख सीमाओं में से एक है एएवी वेक्टर (एस) को वयस्क स्तनधारियों में गहरी मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के पैरेन्काइमा को देने की सीमित क्षमता।
उदाहरण के लिए, यह दर्शाया गया था कि वयस्क कृन्तकों, बिल्लियों, या गैर-मानव प्राइमेट में एएवी 9 की प्रणालीगत वितरण केवल मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 1 , 2 , 3 में न्यूरॉन्स में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में मामूली प्रभावी है। एएवी 9 वैक्टर के अधिक प्रभावी इंट्रैथैलिक डिलीवरी को न्यूरॉन्स के शारीरिक-परिभाषित पूल में केवल सीमित ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के रूप में दिखाया गया है। अधिक विशेष रूप से, यह राक्षसों की गई हैगैर-मानव प्राइमेट, सूअर या कृन्तकों में cisternal या lumbo-sacral intrathecal एएवी 9 वितरण trated कि रीढ़ की हड्डी α-motoneurons और खंडीय पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में transgene अभिव्यक्ति के एक उच्च स्तर की ओर जाता है। हालांकि, सफेद पदार्थों में रीढ़ की हड्डी के इंटर्न्यूरोन या आरोही या अवरोही अक्षों में न्यूनतम या कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखती है 4 , 5 , 6 , 7 । सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एक अत्यधिक प्रभावी जैविक-संरचनात्मक बाधा मौजूद है, जो अंतर्निहित रूप से एएवी को गहरा रीढ़ की हड्डी वाले पैरेन्काइमा में वितरित करने से रोकती है।
वयस्क चूहों और सूअरों का उपयोग करते हुए पिछले एक अध्ययन में, उपन्यास उप-वैक्टर वितरण तकनीक 8 विकसित हुई थी। इस दृष्टिकोण का प्रयोग करके, एकल-बोल्ट उप-वास एएवी 9 वितरण के बाद अत्यधिक शक्तिशाली और बहु-खंडीय ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया था। तीव्र GFP अभिव्यक्ति लगातार देखा थाइंजेक्शन रीढ़ की हड्डी वाले क्षेत्रों के माध्यम से न्यूरॉन्स, ग्लिअल कोशिकाएं और अवरोही / आरोही एशंस में यह अध्ययन पहली बार दिखाया गया है कि पिया मेटर प्राथमिक बाधा का प्रतिनिधित्व करता है जो कि एस्ट्रॉलिएक स्पेस से स्पाइनल पैरेन्काइमा में प्रभावी एएवी 9 प्रसार को सीमित करता है। हालांकि यह पहले से विकसित तकनीक और उप-इंजेक्शन डिवाइस बड़े कृन्तकों (जैसे चूहे) या वयस्क सूअरों में उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, तो सिस्टम छोटे जानवरों जैसे कि वयस्क चूहों में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है। विभिन्न प्रकार के न्यूरोड अभिकर्मक विकारों के उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की वजह से, चूहों में एक प्रभावी रीढ़ की हड्डी-पैरेन्चैमिकल वेक्टर डिलीवरी तकनीक के विकास की स्पष्ट आवश्यकता है। इस तरह की तकनीक की उपलब्धता विशिष्ट जीन मुंह बंद करने के प्रभाव ( जैसे, एसआरएएनए का उपयोग कर) या सेल-गैर-विशिष्ट ( जैसे, साइटोमैगलवायरस-सीएमवी या यूबीइक्विटीन) या सेल-विशिष्ट ( जैसे, सिनापसिन या ग्लियाल तंतुमय अम्लीयप्रोटीन (जीएफएपी)) प्रारंभिक प्रसवपूर्व विकास के दौरान या बीमार रोगों के तहत प्रमोटरों।
तदनुसार, वर्तमान अध्ययन में, हमने एक लघु उपशास्त्रीय वेक्टर डिलीवरी सिस्टम विकसित और मान्य किया है जो प्रौढ़ चूहों में प्रभावी रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह, पिछली चूहे और सुअर अध्ययनों के अनुसार, यह काम चूहों में एकल-बोल्ट उपायुक्त एएवी 9 डिलीवरी के बाद स्पाइनल पैरेन्काइमा में शक्तिशाली ट्रांसजीन अभिव्यक्ति दर्शाता है। इस दृष्टिकोण की सादगी, सुपारी एएवी 9 वितरण में इंजेक्शन चूहों की बहुत अच्छी सहनशीलता, और स्पाइनल पैरेन्काइमा में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति की उच्च शक्ति का सुझाव है कि यह तकनीक प्रभावी ढंग से किसी भी प्रयोगशाला सेटिंग में लागू की जा सकती है और रीढ़ की हड्डी जीन अभिव्यक्ति
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन वयस्क चूहों में उप-वैक्टर (एएवी 9) डिलीवरी की एक तकनीक का वर्णन करता है। जैसा कि साथ वीडियो में दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण और तकनीक को प्रभावी रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते स्थाप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन का समर्थन SANPORC और ALSA फाउंडेशन अनुदान (मार्टिन मार्सला) द्वारा किया गया था; राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम, परियोजना संख्या LO1609 (चेक शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय); और आरवीओ: 67985904 (स्टीफन जुहास और जान जुहसोवा)।
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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