Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss
Summary
Målet med den föreliggande studien var att utveckla och validera styrkan och säkerheten hos spinal adenoassocierad virus 9 (AAV9) -medierad genavgivning genom att använda en ny sub-gengenleveranssteknik i vuxna möss.
Abstract
Den framgångsrika utvecklingen av en subeniell adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektortillförselsteknik hos vuxna råttor och svin har tidigare rapporterats. Med användning av subpellentplacerade polyetenkatetrar (PE-10 eller PE-5) för AAV9-tillförsel har starkt transgenuttryck genom spinalparenchyma (vitt och grått ämne) i subpially-injicerade ryggsegment visat sig. På grund av det brett spektrumet av transgena musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar finns det en stark önskan att utveckla en kraftig centreringssystem (CNS) med målinriktade vektorleveranser i vuxna möss. Följaktligen beskriver den föreliggande studien utvecklingen av en spinal subpiell vektoravgivningsanordning och teknik för att möjliggöra säker och effektiv spinal-AAV9-leverans i vuxna C57BL / 6J-möss. I spinalt immobiliserade och bedövade möss skärs pia materen (cervikal 1 och ländryggen 1-2 spinal segmentnivå) med en skarp 34 G nål med användning av en XYZ manipulator. En andra XYZ maNipulatorn användes sedan för att förflytta en trubbig 36G nål till ländryggen och / eller livmoderhalsunderlaget. Den AAV9 vektorn (3-5 pl; 1,2 x 10 13 genomet kopior (gc)) som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) var injicerades sedan subpially. Efter injektioner utvärderades den neurologiska funktionen (motorisk och sensorisk) periodiskt och djur perfusionsfixerades 14 dagar efter AAV9-tillförsel med 4% paraformaldehyd. Analys av horisontella eller transversala ryggmärgsektioner visade transgenuttryck i hela ryggmärgen, både i grå och vit materia. Dessutom sågs intensivt retrogradel-medierat GFP-uttryck i de nedåtgående motoraxonen och neuronerna i motorcortexen, kärnrubbningen och formatio reticularis. Ingen neurologisk dysfunktion noterades i några djur. Dessa data visar att subpialvektortillförselstekniken framgångsrikt kan användas i vuxna möss utan att orsaka procedurrelaterad ryggmärgsskada och är associerad med högeffektiva transgena uttryckSion genom hela ryggmärgsneuraxen.
Introduction
Användningen av AAV-vektorer för att behandla en rad ryggmärgs- och CNS-neurodegenerativa störningar blir en väl accepterad plattform för att effektivt uppreglera eller tysta uttrycket av gen (er) av intresse. En av de viktigaste begränsningarna för det mer effektiva utnyttjandet av denna teknik för behandling av CNS / ryggmärgsstörningar är den begränsade förmågan att leverera AAV-vektor (er) till den djupa hjärnan eller ryggmärgsparenchymen hos vuxna däggdjur.
Det visades exempelvis att den systemiska avgivningen av AAV9 hos vuxna gnagare, katter eller icke-humana primater endast är måttligt effektiv vid inducering av transgenuttryck i neuroner i hjärnan och ryggmärgen 1 , 2 , 3 . Den mer effektiva intratekala leveransen av AAV9-vektorer har också visat sig leda till endast begränsat transgenuttryck i anatomiskt definierade bassänger av neuroner. Mer specifikt har det varit demonerTrated att den cisternal eller lumbo-sacral intratekal AAV9-leveransen i icke-humana primater, grisar eller gnagare leder till en hög nivå av transgenuttryck i spinal-a-motoneuroner och segmentala dorsala rotganglionneuroner. Minst eller inget uttryck i spinalinteruroner eller stigande eller fallande axoner i den vita substansen ses dock 4 , 5 , 6 , 7 . Sammantaget visar dessa data att en hög effektiv biologisk-anatomisk barriär finns, vilket förhindrar diffusion av intratekalt levererad AAV till djupare ryggradsparenchyma.
I en tidigare studie med användning av vuxna råttor och grisar utvecklades en ny subpielvektoravgivningsteknik 8 . Med användning av detta tillvägagångssätt demonstrerades starkt och multisegmentalt transgenuttryck efter en subkulär AAV9-leverans med en-bolus. Intensivt GFP-uttryck observerades konsekventI neuroner, glialceller och nedåtgående / stigande axoner genom de injicerade ryggradssegmenten. Denna studie visade för första gången att pia-materen representerar den primära barriärbegränsande effektiva AAV9-diffusionen i ryggradsparenchymen från det intratekala utrymmet. Även om denna tidigare utvecklade teknik och subpialinjektionsanordning är relativt lätt att använda hos stora gnagare (som råttor) eller vuxna grisar, är systemet inte lämpligt för användning i små djur, såsom vuxna möss. På grund av det höga antalet tillgängliga transgena musmodeller av en mängd neurodegenerativa störningar föreligger ett tydligt behov av utveckling av en effektiv spinalparenkymalvektortillverkningsteknik hos möss. Tillgängligheten av en sådan teknik skulle möjliggöra studier av effekten av specifik genavstämning ( t.ex. användning av shRNA) eller uppreglering med användning av cellspecifik ( t.ex. cytomegalovirus-CMV eller Ubiquitin) eller cellspecifik ( t.ex. synapsin eller glial Fibrillärt surtProtein (GFAP)) promotorer under tidig postnatalt utveckling eller under sjuka tillstånd.
Följaktligen har vi i den föreliggande studien utvecklat och validerat ett miniatyr subpulsvektoravgivningssystem som effektivt kan användas i vuxna möss. På samma sätt, som i tidigare råtta och grisstudier, demonstrerar detta arbete starkt transgenuttryck i hela ryggmärgs parenchymen efter en leverans med en-bolus subpial AAV9 hos möss. Enkelheten i detta tillvägagångssätt, den mycket goda toleransen hos injicerade möss till subpiel AAV9-leverans och den höga styrkan hos transgenuttryck i ryggmärgs parenchymen antyder att denna teknik effektivt kan implementeras i vilken laboratorieinställning som helst och användes i experiment som riktar sig mot spinal-genuttryck.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella studien beskriver en teknik för subpiell vektor (AAV9) leverans hos vuxna möss. Såsom visas i den medföljande videon kan detta tillvägagångssätt och teknik effektivt användas, under förutsättning att de nödvändiga instrumenten och den pia-penetrerande nålen och subpialinjektionsnålen tillverkas korrekt enligt de fastställda och testade specifikationerna.
Kritiska tekniska variabler vid utförande av en konsekvent och säker subpialinjektion hos möss:</str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av SANPORC och ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Det nationella hållbarhetsprogrammet, projektnummer LO1609 (tjeckiska ministeriet för utbildning, ungdom och idrott); Och RVO: 67985904 (Stefan Juhas och Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
