Summary
Das CRISPR-assoziierte Protein Cpf1 kann durch eine speziell entwickelte CRISPR-RNA (crRNA) geführt werden, um doppelsträngige DNA an gewünschten Stellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde ein DNA-Assembler-Standard (C-Brick) etabliert, und ein Protokoll, das seine Verwendung beschreibt, wird hier beschrieben.
Abstract
CRISPR-assoziiertes Protein Cpf1 spaltet doppelsträngige DNA unter der Leitung von CRISPR RNA (crRNA) und erzeugt klebrige Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde Cpf1 für die Etablierung eines DNA-Assembler-Standards namens C-Brick verwendet, der den Vorteil von langen Erkennungsstellen und kurzen Narben hat. Auf einem Standard-C-Brick-Vektor gibt es vier Cpf1-Erkennungsstellen - das Präfix (T1- und T2-Standorte) und das Suffix (T3- und T4-Standorte) - flankierende biologische DNA-Teile. Die Spaltung von T2- und T3-Stellen erzeugt komplementäre klebrige Enden, die die Montage von DNA-Teilen mit T2- und T3-Stellen ermöglichen. Mittlerweile wird eine kurze "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen nach der Montage erzeugt. Da das neu gebildete Plasmid noch einmal die vier Cpf1-Spaltstellen enthält, erlaubt die Methode die iterative Assemblierung von DNA-Teilen, die denjenigen von BioBrick- und BglBrick-Standards ähnlich ist. Ein Verfahren, das die Verwendung des C-Brick-Standards zur Zusammenstellung von DNA-Teilen skizziertWird hier beschrieben. Die C-Brick-Standard kann weit verbreitet von Wissenschaftlern, Absolventen und Studenten und sogar Amateure verwendet werden.
Introduction
Die Standardisierung von DNA-biologischen Teilen ist wichtig für die Entwicklung der synthetischen Biologie 1 . Die Entwicklung eines DNA-Assemblierungsverfahrens kann Ad-hoc- experimentelle Entwürfe ersetzen und viele der unerwarteten Ergebnisse entfernen, die bei der Montage von genetischen Komponenten in größere Systeme entstehen. Der BioBrick Standard (BBF RFC 10) war einer der frühesten vorgeschlagenen DNA Assembly Standards. Es verwendet die Präfixsequenz (die EcoRI- und XbaI-Schneidstellen enthält) und die Suffixsequenz (die SpeI- und PstI-Schneidstellen enthält) 2 , 3 . Da XbaI und SpeI komplementäre zusammenhängende Enden haben, können BioBrick DNA-Teile, die mit XbaI und SpeI geschnitten werden, miteinander verbunden werden und einen neuen BioBrick für eine weitere iterative Montage erzeugen.
Bei der Verwendung des BioBrick-Standards 4 wurden einige Mängel festgestellt. Zum Beispiel produziert es eine 8-bp-NarbeZwischen den DNA-Teilen, die nicht die Konstruktion von In-Fusionsproteinen ermöglicht. Außerdem müssen die vier vorgenannten Typen von 6-bp-Restriktionsstellen aus den DNA-Teilen entfernt werden, was sehr unpraktisch ist. Der BglBrick-Standard wurde eingerichtet, um das erste Problem zu lösen 5 . Es schafft eine 6-bp "GGATCT" Narbe, die Herstellung von Gly-Ser und ermöglicht die Fusion von mehreren Proteinen oder Protein-Domains. IBrick wurde entwickelt, um mit dem zweiten Problem umzugehen 6 . Es verwendet Homing-Endonukleasen (HEs), die lange DNA-Sequenzen erkennen. Da die Erkennungsstandorte selten in natürlichen DNA-Sequenzen existieren, kann der iBrick-Standard für den direkten Aufbau von iBrick-Teilen ohne Modifikation ihrer DNA-Sequenzen verwendet werden. Allerdings verlässt der iBrick-Standard eine 21 bp-Narbe zwischen den DNA-Teilen, was der Grund für seine Unbeliebtheit sein könnte.
In den letzten Jahren gingen die gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Wiederholungen (CRIS) zusammenPR) System hat sich schnell entwickelt 7 , 8 . Unter den CRISPR-assoziierten (Cas) Proteinen ist Cas9 Endonuklease aus Streptococcus pyogenes heute weit verbreitet . Es führt meist doppelsträngige DNA-Pausen (DSBs) mit stumpfen Enden 9 ein .
Im Jahr 2015 charakterisierten Zhang und Mitarbeiter Cpf1 (CRISPR von Prevotella und Francisella 1) zum ersten Mal. Es gehört zum Klasse-2-Typ-V-CRISPR-Cas-System und ist eine CRISRP-RNA (crRNA) -geführte Endonuklease 10 . Im Gegensatz zu Cas9 führt Cpf1 einen DSB mit einem 4 oder 5 nt 5 'Überhang 10 ein . Basierend auf dieser Eigenschaft wurde Cpf1 verwendet, um einen DNA-Assemblystandard C-Brick 4 zu entwickeln. Auf einem C-Brick-Standardvektor flankieren vier Cpf1-Zielstellen von vorangestellten T1 / T2 und suffixed T3 / T4 die biologischen Teile; Dies ähnelt dem BioBrick-Standard. Als Spaltung von T2- und T3-Stellen pFührt zu komplementären klebrigen Enden, es ist möglich, die iterative Anordnung von DNA-Teilen durchzuführen, während eine "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen erzeugt wird. Bemerkenswerterweise hat der C-Brick-Standard zwei Hauptvorteile: Erkennung langer Zielsequenzen und kurzer Narben. Die von C-Brick erzeugte 6 bp "GGATCC" Narbe kodiert Gly-Ser, was den Aufbau von Fusionsproteinen ermöglicht. Darüber hinaus ist der C-Brick-Standard auch teilweise mit den BglBrick- und BioBrick-Standards kompatibel.
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Protocol
1. Vorbereitung von crRNA
- Vorbereitung von crRNA-Vorlagen
- Die Oligonukleotide ( Tabelle 1 ) in RNase-freiem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM erneut suspendieren.
- Füge 22,5 μl Top-Strang-Oligonukleotid (T7-F in Tabelle 1 ), 22,5 μl Bottomstrang-Oligonukleotid ( Tabelle 1 ) und 5 μl 10x-Annealing-Puffer zu einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
ANMERKUNG: Sechs verschiedene untere Strang-Oligonukleotide sind in Tabelle 1 gezeigt , von denen jede einzeln mit dem Top-Strang T7-F gepaart werden sollte. Die Kleinbuchstaben in Tabelle 1 stellen die zu transkribierende Sequenz in die Führungssequenz von crRNA dar. 10x Taq PCR Puffer kann anstelle des 10x Glühpuffers verwendet werden. - Legen Sie die PCR-Röhre in einen Thermocycler.
- Führen Sie das Glühprogramm aus: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für5 min und dann eine Abklingzeit von 95-20 ° C, mit einer 1 ° C Abnahme pro Minute auf dem Thermocycler.
HINWEIS: Sofort die Proben für Schritt 1.2.1 verwenden.
- Transkription und Reinigung von crRNA
- Zugabe von 38 μl RNase-freiem Wasser, 8 μl der Matrize aus Schritt 1.1.4, 20 μl 5x T7 Transkriptionspuffer, 20 μl NTP-Gemisch (10 μM), 4 μl rekombinantem RNase-Inhibitor (RRI) und 10 ΜL T7-RNA-Polymerase zu einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 100 μl beträgt.
- Das Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht in ein 37 ° C Wasserbad geben (ca. 16 h).
- Verwenden Sie einen RNA-Cleanup- und Konzentrations-Kit, um die transkribierte RNA zu reinigen. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Quantifizieren Sie die RNAs mit UV-Vis-Spektrophotometern und verdünnen Sie die RNA auf eine Konzentration von 10 μM. Benutzen Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -80 ° C.
HINWEIS: Die crRNA-SequenzS sind in Tabelle 2 aufgelistet .
2. Konstruktion von C-Brick Parts ( dh das Einfügen von biologischen Teilen in einen C-Brick Standard Vector)
HINWEIS: Dieser Schritt hat drei Teilschritte. Für kurze biologische Teile ( z. B. Promotoren und Terminatoren) ist es am besten, die direkte PCR-Methode zu verwenden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor 4 einzusetzen. Die gesamte Vektorsequenz wird in den ergänzenden Daten gezeigt, und die Präfix- und Suffixsequenz ist in Fig. 1 gezeigt (Schritt 2.1, unten). Für biologische Teile, die leicht über PCR erhalten werden können ( z. B. mit Templaten von genomischen DNA, Plasmiden oder de novo synthetisierten DNA-Sequenzen), ist es am besten, das nahtlose Assemblierungsverfahren zu verwenden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor einzusetzen (Schritt 2.2, unten). Für diejenigen Teile aus BioBrick und BglBrick Standards, BeschränkungEnzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation können verwendet werden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor einzusetzen (Schritt 2.3 unten).
- Aufbau durch direkte PCR-Verstärkung
- Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
HINWEIS: Das 5'-Ende des Oligonukleotids enthält die Sequenz des DNA-Teils und das 3'-Ende des Oligonukleotids enthält die Vektorsequenz ( dh "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" am 3'-Ende des Vorwärtsstranges und "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Im umgekehrten strang). Entweder kann kein Überhang oder ein ~ 20-bp-Überhang am 5'-Ende des Oligonukleotids entworfen werden. Spezielle Beispiele finden sich in einer früheren Studie 4 . - Die Oligonukleotide in ultrareinem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM erneut suspendieren.
- PCR-Reaktionen auf Eis in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen aufbauen: 18 μl ultrareines Wasser geben, 25 μl 2x PCR-Puffer, 1 & mgr; l DNTPs (10 & mgr; M), jeweils 2,5 & mgr; l der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 & mgr; M) aus Schritt 2.1.2, 0,5 & mgr; l C-Brick-Standardvektor (50 ng) als Matrize und 0,5 & mgr; l Von High-Fidelity-DNA-Polymerase. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
- Legen Sie die Röhre direkt in einen Thermocycler und starten Sie das Thermocycler-Programm. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Thermocycler-Programm: ein Zyklus für 3 min bei 98 ° C; Dreißig Zyklen für 10 s bei 98 ° C, 20 s bei 55 ° C und 2 min bei 72 ° C; Und einen Zyklus für 10 min bei 72 ° C. Halten Sie die Probe bei 16 ° C.
- Zugabe von 9 μl der Mischung aus Schritt 2.1.4 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- 1 μl DpnI zugeben und 1 h in einem Wasserbad von 37 ° C inkubieren.
HINWEIS: Wenn die Primer keine überlappenden Sequenzen haben, fügen Sie 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase (PNK) und 0,5 μl T4-DNA-Ligase hinzu und inkubieren inEin 22 ° C Wasserbad für 1 h. Andernfalls, wenn die Primer eine ~ 20 nt überlappende Sequenz enthalten, transformieren Sie die DpnI-behandelten Produkte direkt in E. coli (DH10B) -kompetente Zellen (Schritt 2.4). Das linearisierte PCR-Produkt wird durch das Rekombinationssystem im Wirt zirkuliert. - Benutzen Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
- Aufbau durch nahtlose Montage
- Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
HINWEIS: Das 3'-Ende des Oligonukleotids enthält die terminale Sequenz des DNA-Teils und das 5'-Ende des Oligonukleotids enthält das Ende der linearisierten C-Brick-Standard-Vektorsequenz ( dh "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" für die 5'- -end des vorderen Strangs und "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" für das 5'-Ende des umgekehrten Strangs). Spezielle Beispiele finden sich in einer früheren Studie 4 . - Das einzeln aussetzenUal-Oligonukleotiden in ultrareinem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM
- PCR-Reaktionen auf Eis in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen aufbauen: 18 μl ultrareines Wasser, 25 μl 2x PCR-Puffer, 1 μl dNTPs (10 μM), 2,5 μl jeweils die Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM ) Aus Schritt 2.2.2, 0,5 μl Schablone (20-500 ng) und 0,5 μl hochflexitiver DNA-Polymerase. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
- Legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler und führen Sie das Thermocycler-Programm. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
HINWEIS: Das Thermocycler-Programm auf: einen Zyklus für 3 min bei 98 ° C einstellen; 30 Zyklen für 10 s bei 98 ° C, 20 s bei 55 ° C (nach der Glühtemperatur des Primers) und 1 min (je nach Länge der biologischen Teile) bei 72 ° C; Und einen Zyklus für 10 min bei 72 ° C. Halten Sie die Probe bei 16 ° C. - Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR Cleanup SysTem kit; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Digitieren Sie den C-Brick-Standardvektor mit BamHI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (1 μg), 5 μl 10x Puffer und 1 μl BamHI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Inkubieren für bis zu 2 h bei 37 ° C im Wasserbad.
- Reinigen Sie das obige Produkt mit einem Gel Cleanup System Kit; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Füge 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.2.7, 5 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.2.4, 2 μl 5x nahtloser Montagepuffer und 1 μl nahtloses Montageenzym aus einem nahtlosen Montagekit hinzu Zu einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 10 μl beträgt.
- Legen Sie diese in ein 37 ° C Wasserbad für 30 min. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
- Aufbau durch Restriktionsenzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation.
HINWEIS: Für diejenigen Teile, die aus dem BioBrick (Schritt 2.3.4-2.3.7) und BglBrick (Schritt 2.3.1-2.3.3) Standards gewonnen wurden, können Restriktionsenzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation verwendet werden, um die Biologischen Teilen in einen C-Brick-Standard-Vektor.- Die BglBrick-Standardteile mit BamHI und BglII verdauen: 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (2 μg), 5 μl 10x Puffer 3, 0,5 μl BamHI und 0,5 μl BglII in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
- Führen Sie eine 1% Agarose-Gelelektrophorese und reinigen Sie das Fragment mit einem Gel Cleanup System Kit.
- Ligat das Fragment und der C-Brick-Standardvektor: 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.1.12 und 6 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.3.3 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zugeben. Füge 1 μl 10 x T4 DNA Ligase Puffer und 1 μl T4 DNA Ligase hinzu. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder freezE und lagern bei -20 ° C.
- Diginieren Sie die BioBrick-Standardteile mit XbaI und SpeI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (2 μg), 5 μl 10x Puffer, 0,5 μl XbaI und 0,5 μl SpeI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
- Digzen Sie den C-Brick-Standardvektor mit XbaI und SpeI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (1 μg), 5 μl 10x Puffer, 0,5 μl XbaI und 0,5 μl SpeI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu . Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
- Führen Sie eine 1% Agarose-Gelelektrophorese aus und reinigen Sie das Fragment aus Schritt 2.3.4 und den linearisierten Vektor aus Schritt 2.3.5 mit einem Gel-Cleanup-System-Kit; Nach dem Protokoll des Herstellers.
- Ligat das Fragment und der C-Brick-Vektor: 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.3.5 und 6 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.3.4 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zugeben. AnzeigeD 1 & mgr; l 10 × T4-DNA-Ligasepuffer und 1 & mgr; l T4-DNA-Ligase. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Fügen Sie 10 μl der Produkte aus Schritt 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 oder 2.3.7 für die chemische Umwandlung in die kompetenten Zellen von E. coli (DH10B) hinzu.
- Nehmen Sie mehrere Klone zu einem 5-ml flüssigen Luria-Bertani (LB) Röhrchen auf und inkubieren bei 37 ° C auf einem Shaker (220 U / min) über Nacht.
- Extrahieren des Plasmids unter Verwendung eines Plasmidpräparationskits; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Identifizierung der richtigen Klone durch Sanger-Sequenzierung 11 .
3. C-Brick Assembly ( Abbildung 2 )
- Verdauung des C-Brick-Vektors mit Cpf1
- Füge 22,5 μl RNase-freies Wasser, 4 μl 10x Cpf1-Puffer, 10 μl des Plasmids aus Schritt 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI und 1 &# 181; L von Cpf1 (5 μM) zu einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Cpf1 kann nach einer vorherigen Studie kommerziell gekauft oder gereinigt werden. - Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, wird 1 μl CrRNA-T2 (10 μM) zugegeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min inkubiert. Eine dd 1 & mgr; l CrRNA-T1 (10 & mgr; M) und Cpf1 (5 & mgr; M) für weitere 30 min.
HINWEIS: Um ein fremdes DNA-Fragment in die T3- und T4-Stellen einzufügen, fügen Sie 1 μl CrRNA-T3 (10 μM) hinzu und inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. 1 & mgr; l CrRNA-T4 (10 & mgr; M) für weitere 30 min zugeben. - 1 & mgr; l wärmeempfindliche alkalische Phosphatase zugeben und das Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für weitere 1 h inkubieren.
- Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie den Vektor mit einem Gel-Cleanup-System-Kit. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Fügen Sie 21,5 μl RNase-freies Wasser, 4 μl 10x Cpf1-Puffer, 10 μl Plasmid aus Schritt 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI und 2 μL Cpf1 (5 μM) zu einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
- Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, werden 1 μl CrRNA-T1 (10 μM) und 1 μl CrRNA-T3 (10 μM) zugegeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 h inkubiert.
HINWEIS: Alternativ dazu 1 μl CrRNA-T2 (10 μM) und 1 μl crRNA-T4 (10 μM) zugeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 h inkubieren. - Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie das Fragment mit einem Gel-Cleanup-System-Kit. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Füge 22,5 μl RNase-freies Wasser, 4 μl 10x Cpf1-Puffer, 10 μl des Plasmids aus Schritt 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI und 1 &# 181; L von Cpf1 (5 μM) zu einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
- C-Brick Montage und weitere Überprüfung
- Ligat das fremde DNA-Fragment und C-Brick-Vektor: 2 μl des linearisierten Vektors (50 ng) aus Schritt 3.1.4 und 6 μl des DNA-Fragments (200 ng) aus Schritt 3.2.3 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Füge 1 μl 10x T4 DNA Ligase Puffer und 1 μl T4 DNA Ligase hinzu. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Fügen Sie 10 μl der Ligationsprodukte (Schritt 3.3.1) für die chemische Umwandlung in E. coli (DH10B) -kompetenten Zellen hinzu.
- Fügen Sie mehrere Klone zu einem 5 ml flüssigen LB-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht auf einem Schüttler bei 220 U / min und 37 ° C.
- Extrahieren des Plasmids unter Verwendung eines Plasmidpräparationskits; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Identifizieren Sie korrekte Klone durch Sanger-Sequenzierung 11 .
- Führen Sie eine neue Runde von C-Brick Montage. Korrekte Klone aus Schritt 3.3.4 können als neuer C-Brick-Vektor oder DNA-Teil für weitere iterative C-Brick-Assembly nach dem gleichen Protokoll aus den Schritten 3.1-3.3 verwendet werden.
HINWEIS: T2 'und T3' sItes sind als Backup von T2- und T3-Standorten konzipiert ( Abbildung 1a ). Für Plasmide, die aus Schritt 2.3.7 erhalten wurden, können nur T2 'und T3' für die C-Brick-Standardanordnung verwendet werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll zeigte die Zusammenstellung von drei Chromoproteinkassetten (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) und amilGFP (BBa_K592010)). Zuerst wurden die kodierenden Sequenzen der drei vorgenannten Gene und Terminatoren einzeln in einen C-Brick-Standardvektor kloniert. Kurze DNA-Teile, Promotor und Terminator wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die die kurzen DNA-Teile am 5'-Terminus enthalten, in den C-Brick-Vektor eingeführt. Darauf folgte die Selbstligationsmethode. Drei chromoprotein-kodierende Sequenzen wurden zuerst de novo synthetisiert und dann durch nahtlose Assemblierung in den C-Brick-Standardvektor kloniert. Die Primer wurden in einer früheren Studie beschrieben 4 .
Danach wurden cjBlue-, eforRed- und amilGFP-Sequenzen mit Terminator- und Promotorsequenzen in der gleichen Prozedur ligiert"Xfig"> Abbildung 2 Korrekte Konstrukte wurden in E. coli umgewandelt und zeigen schöne Farben (Abbildung 3a ). Anschließend wurden zwei Farbausdruckkassetten mit dem C-Brick-Standard zusammengebaut, um mehr Farben zu erzeugen ( dh die rote Farbe von amilGFP plus eforRed, die grüne Farbe von amilGFP plus cjBlue und die hellviolette Farbe von eforRed plus cjBlue; 3b ).
Abbildung 1: C-Brick Standard Interface DNA Sequenz und C-Brick Standard Vector. ( A ) Die Sequenz der C-Brick-Standardschnittstelle-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-kann durch ihre entsprechende crRNA erkannt und dann in einen 5'-Überhang unter Verwendung von Cpf1 eingeführt werden. Die Spaltung von T2- und T3- (oder T2- und T3'-) Stellen ergibt komplementärhängt. Mit den acht eingesetzten Restriktionsstellen ist der C-Brick Standard teilweise mit BioBrick und BglBrick kompatibel. ( B ) Plasmid-Map für den C-Brick-Standardvektor mit Restriktionsverdauungsstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Der Workflow für die DNA-Assembly im C-Brick-Standard. Cpf1-verdaute T2- und T3-Zielstellen produzieren komplementäre zusammenhängende Enden von "GGATC" bzw. "GATCC", die ligiert werden können, um eine kurze "GGATCC" Narbe zu erzeugen. Detaillierte Verfahren finden Sie in Schritt 3 im Text ("C-Brick Assembly"). Bitte hier klicken Sehen Sie eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bunte Bakterienpigmente, hergestellt von E. coli Harboring Constructs, zusammengebaut im C-Brick Standard. ( A ) Drei Chromoproteine wurden in E. coli exprimiert, die auf einer Platte gezüchtet wurden. Bakterien ohne Chromoproteine (Negativkontrolle) sind auf der 4. Platte gezeigt. ( B ) Drei Chromoproteine und drei zusammengesetzte Doppelchromoproteine wurden in E. coli exprimiert, die in flüssigem LB-Medium gezüchtet wurden. Von 1 bis 6 exprimierten die Konstrukte eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) und eforRed plus cjBlue (6). Die bunten Bakterien auf einer einzigen Platte oder in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen wurden aus einem einzigen Sequenz-verifizierten Klon kultiviert. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Name | Sequenz | ||
| T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
| T7-T1-R | GaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2'-R | CtagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2-R | GgatcctttctctctttagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3-R | GgatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3'-R | CtctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T4-R | TtcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
Tabelle 1: Oligos für die Herstellung der in dieser Studie verwendeten crRNA-Transkriptionsvorlagen. T7-F war das Top-Strang-Oligonukleotid, und die anderen waren die Bottom-Strang-Oligonukleotide. Die Kleinbuchstaben in der Sequenz werden in die Führungssequenz in crRNA transkribiert.
| Namen | RNA-Sequenzen (5'-3 ') | ||
| CrRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
| CrRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
| CrRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
| CrRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCKUUGAA | ||
| CrRNA-T2 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
| CrRNA-T3 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG | ||
Tabelle 2: Die in dieser Studie verwendeten crRNA-Sequenzen Die crRNAs wurden durch die in vitro- Transkription in Schritt 1 im Text ("Präparation von crRNA") hergestellt.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für den DNA-Assemblierungsstandard C-Brick. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Linearisierung des C-Brick-Standardvektors; Eine unvollständige Spaltung des Vektors könnte die Erfolgsquote ernsthaft beeinträchtigen. Zusätzlich, obwohl Cpf1 hauptsächlich Ziel-DNA-Sequenzen in dem "18-23" -Spaltmuster spaltet, wurde auch eine ungenaue Spaltung nahe den beiden Basen 4 nachgewiesen, was eine kleine Anzahl von Mutationen nach der DNA-Assemblierung verursachen kann. Daher ist eine Sanger-Sequenzierung erforderlich, um das zusammengesetzte Konstrukt zu verifizieren.
Die Effizienz der C-Brick-Anordnung ist geringer als herkömmliche Restriktionsenzym- und Ligationsmethoden, die in einer früheren Studie beschrieben wurden 4 . Der Hauptgrund, der die Montageeffizienz beeinflusst, kann die ungenaue Spaltungseigenschaft von Cpf1 sein. In Zukunft können Verbesserungen der Spaltgenauigkeit für den Standard a nützlich seinWerden derzeit erforscht.
C-Brick ist auch teilweise kompatibel mit den BglBrick- und BioBrick-Standards. Zum Beispiel können BglBrick-Teile mit BglII und BamHI geschnitten und dann in die BamHI-Stelle eines C-Brick-Standardvektors eingefügt werden, wodurch ein C-Brick-Teil erzeugt wird. Allerdings sollte die Insertionsrichtung des BglBrick-Teils überprüft werden, und es würde eine "GGATCT" -Farbe nach der Montage geben. Wenn ein C-Brick-DNA-Teil aus einem BioBrick-Teil ( dh mit XbaI und SpeI-Verdauung) erhalten wird, werden sowohl T2- als auch T3-Stellen zerstört und zwei Backup-Cpf1-Zielsequenzen (T2 'und T3') verwendet.
Da die Cpf1-Spaltung sgRNA erfordert, die für RNase extrem empfindlich ist, sollten alle Materialien RNase-frei sein. Derzeit können alle C-Brick-Standardvektoren, RNase-freie Cpf1-Nukleasen und crRNAs im Handel 12 bestellt werden. Daher sind die Verfahren für C-Brick eigentlich so einfach wie die der BioZiegel Standard.
In den vergangenen Jahren wurden mehrere nützliche DNA-Assemblierungsverfahren entwickelt und sind weit verbreitet, einschließlich der Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 und anderen 15 . Da jedoch DNA-Assemblierungsstandards das Potenzial haben, kostengünstige, zuverlässige, hochdurchsatz- und automatische Montagereaktionen 5 bereitzustellen, können Standards den Aufbau und die Prüfung von neu konstruierten oder neu entworfenen Genen, genetischen Schaltungen und Wegen 15 , 16 , 17 , insbesondere auf dem Gebiet der synthetischen Biologie. Unter den derzeit veröffentlichten DNA-Assemblierungsstandards hat der C-Brick-Standard sowohl offensichtliche Vor- als auch Nachteile 4 ( dh die Ligationseffizienz). Wenn die Ligationseffizienz verbessert wird, kann der Standard in der Zukunft weithin angenommen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Shanghai Tolo Biotech für ihre technische Unterstützung bei der Entwicklung des C-Brick Standards. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Strategischen Schwerpunktforschungsprogramm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Grant Nr. XDB19040200) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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