Protokoll för C-Brick-DNA-standardmontering med användning av Cpfl
Summary
CRISPR-associerat protein Cpf1 kan styras av ett speciellt konstruerat CRISPR-RNA (crRNA) för att klyva dubbelsträngat DNA vid önskade ställen, vilket genererar klibbiga ändar. Baserat på denna egenskap etablerades en DNA-monteringsstandard (C-Brick), och ett protokoll som beskriver dess användning beskrivs här.
Abstract
CRISPR-associerat protein Cpfl klyver dubbelsträngat DNA under ledning av CRISPR RNA (crRNA), vilket alstrar klibbiga ändar. På grund av denna egenskap har Cpf1 använts för inrättandet av en DNA-monteringsstandard som kallas C-Brick, vilken har fördelen av långa igenkänningsställen och korta ärr. På en vanlig C-Brick-vektor finns fyra Cpf1-igenkänningssidor – prefixet (T1 och T2-sidorna) och suffixet (T3 och T4-sidorna) – flankerande biologiska DNA-delar. Klyvningen av T2- och T3-ställen ger komplementära klibbiga ändar, vilket möjliggör montering av DNA-delar med T2- och T3-ställen. Under tiden genereras en kort "GGATCC" ärr mellan delar efter montering. Eftersom den nybildade plasmiden återigen innehåller de fyra Cpfl-klyvningsställena möjliggör förfarandet det iterativa sammansättningen av DNA-delar, vilket liknar de för BioBrick och BglBrick-standarderna. Ett förfarande som beskriver användningen av C-Brick-standarden för att montera DNA-delarBeskrivs här. C-Brick-standarden kan användas i stor utsträckning av forskare, forskare och studenter, och till och med amatörer.
Introduction
Standardiseringen av DNA-biologiska delar är viktig för utvecklingen av syntetisk biologi 1 . Utvecklingen av ett DNA-sammansättningsförfarande kan ersätta ad hoc- experimentella mönster och avlägsna många av de oväntade resultaten som uppstår vid montering av genetiska komponenter i större system. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en av de tidigaste föreslagna DNA-monteringsstandarderna. Den använder prefix-sekvensen (innehållande EcoRI- och XbaI-skärningssidor) och suffixsekvensen (innehållande SpeI- och PstI-skärningsplatser) 2 , 3 . Eftersom XbaI och SpeI har komplementära sammanhängande ändar kan BioBrick DNA-delar som är skurna med XbaI och SpeI förenas och generera en ny BioBrick för ytterligare iterativ montering.
Vissa defekter har identifierats med användning av BioBrick-standarden 4 . Till exempel producerar den en 8-bitarsärrMellan DNA-delarna, vilket inte tillåter konstruktionen av in-fusionsproteiner. Dessutom måste de fyra ovan nämnda typerna av 6-bp restriktionsställen avlägsnas från DNA-delarna, vilket är mycket obekvämt. BglBrick-standarden fastställdes för att lösa det första problemet 5 . Det skapar en 6-bp "GGATCT" ärr som producerar Gly-Ser och tillåter sammansmältning av flera proteiner eller proteindomäner. IBrick utvecklades för att hantera det andra problemet 6 . Det använder homing endonukleaser (HEs) som känner igen långa DNA-sekvenser. Eftersom HE-igenkänningsställena sällan existerar i naturliga DNA-sekvenser kan iBrick-standarden användas för direkt konstruktion av iBrick-delar utan att modifiera deras DNA-sekvenser. Men iBrick-standarden lämnar en 21 bp ärr mellan DNA-delarna, vilket kan vara orsaken till dess impopularitet.
Under de senaste åren har de grupperade regelbundna mellanrummen korta palindroma upprepningar (CRISPR) systemet har utvecklats snabbt 7 , 8 . Bland de CRISPR-associerade (Cas) proteinerna används Cas9 endonukleas från Streptococcus pyogenes nu allmänt. Det introducerar för det mesta dubbelsträngade DNA-raster (DSB) med trubbiga ändar 9 .
År 2015 kände Zhang och kollegor för första gången Cpf1 (CRISPR från Prevotella och Francisella 1). Det hör till klass 2 typ V CRISPR-Cas-systemet och är ett CRISRP RNA (crRNA) -guided endonukleas 10 . Till skillnad från Cas9 introducerar Cpf1 en DSB med ett 4 eller 5 nt 5 'överhang 10 . Baserat på denna egenskap användes Cpf1 för att utveckla en DNA-monteringsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flankerar fyra Cpfl-målställen av prefixat T1 / T2 och suffix T3 / T4 de biologiska delarna; Detta liknar BioBrick-standarden. Som klyvning av T2- och T3-sidor pLeder till komplementära klibbiga ändar, är det möjligt att utföra det iterativa sammansättningen av DNA-delar medan man genererar ett "GGATCC" ärr mellan delarna. C-Brick-standarden har framförallt två huvudfördelar: erkänner långa målsekvenser och lämnar korta ärr. Den 6 bp "GGATCC" ärr som alstras av C-Brick kodar för Gly-Ser, vilket möjliggör konstruktion av fusionsproteiner. Dessutom är C-Brick-standarden också delvis kompatibel med BglBrick- och BioBrick-standarderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en procedur för DNA-monteringsstandarden C-Brick. Det viktigaste steget i detta protokoll är lineariseringen av C-Brick-standardvektorn; Ofullständig klyvning av vektorn kan på allvar påverka framgångsnivån. Dessutom, även om Cpfl huvudsakligen klibbar mål-DNA-sekvenser i "18-23" -klyvningsmönstret, detekterades också felaktig klyvning nära de två baserna 4 , vilket kan orsaka ett litet antal mutationer efter DNA-montering. Därför behövs Sanger-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shanghai Tolo Biotech för deras tekniska hjälp under utvecklingen av C-Brick-standarden. Detta arbete stöddes av bidrag från det kinesiska vetenskapsakademiens strategiska prioriterade forskningsprogram (bidrag nr XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. . Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
