Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール
Summary
CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。
Abstract
CRISPR関連タンパク質Cpf1は、CRISPR RNA（crRNA）の誘導下で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特徴のために、Cpf1は、長い認識部位および短い傷跡の利点を有するC-ブリックと呼ばれるDNAアセンブリ標準の確立に用いられてきた。標準的なC-Brickベクターには、接頭部（T1およびT2部位）および接尾部（T3およびT4部位） – 隣接する生物学的DNA部分の4つのCpf1認識部位がある。 T2およびT3部位の切断は相補的な粘着末端を生成し、T2およびT3部位を有するDNA部分のアセンブリを可能にする。一方、組立後に部品間に短い「GGATCC」傷が発生する。新たに形成されたプラスミドが再び4つのCpf1切断部位を含むので、この方法は、BioBrickおよびBglBrick標準のものと同様のDNA部分の反復的組み立てを可能にする。 DNA部品を組み立てるためのC-Brick標準の使用法の概要ここで説明します。 C-Brick標準は、科学者、大学院生、学部生、さらにはアマチュアでも広く使用できます。
Introduction
DNA生物学的部分の標準化は、合成生物学の発展にとって重要である1 。 DNAアセンブリ手順の開発は、 臨機応変な実験設計に取って代わることができ、遺伝的構成要素をより大きなシステムに組み立てる際に生じる予想外の結果の多くを除去することができる。 BioBrick標準（BBF RFC 10）は、最も初期に提案されたDNAアセンブリ標準の1つでした。これは接頭配列（EcoRIおよびXbaI切断部位を含む）および接尾配列（SpeIおよびPstI切断部位を含む） 2,3を使用する 。 XbaIとSpeIは相補的な凝集末端を有するため、XbaIとSpeIで切断されたBioBrick DNA部分を結合して、さらなる反復アセンブリのための新しいBioBrickを生成することができる。
BioBrick標準を使用していくつかの欠陥が確認されています4 。例えば、8-bpの傷跡を生じる融合タンパク質の構築を可能にしないDNA部分の間に存在する。さらに、上記の4種類の6bpの制限部位をDNA部分から除去しなければならず、これは非常に不便である。最初の問題を解決するためにBglBrick標準が確立されました5 。これは、6-bpの「GGATCT」傷跡を作り、Gly-Serを産生し、複数のタンパク質またはタンパク質ドメインの融合を可能にする。 iBrickは第2の問題に対処するために開発されました6 。長いDNA配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）を使用します。 HE認識部位は天然のDNA配列にほとんど存在しないので、iBrick標準は、DNA配列を改変することなくiBrick部位の直接構築に使用することができる。しかし、iBrickスタンダードはDNA部分の間に21 bpの傷跡を残します。これは、その不評の理由です。
近年、クラスタリングされた規則的に間隔を置いた短い回文繰り返し（CRISPR）システムが急速に発展した。 CRISPR関連（Cas）タンパク質の中で、 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9エンドヌクレアーゼが現在広く使用されている。大部分は、平滑末端を有する二本鎖DNA切断（DSB）を導入する9 。
2015年に、Zhangと共同研究者は、Cpf1（ PrevotellaとFrancisellaの CRISPR）を初めて特徴付けました 。それはクラス2型V CRISPR-Cas系に属し、CRISRP RNA（crRNA）誘導エンドヌクレアーゼ10である。 Cas9とは異なり、Cpf1は、4または5ntの5 'オーバーハング10を有するDSBを導入する。この特性に基づいて、Cpf1を用いてDNAアセンブリ標準C-Brick 4を開発した。 C-ブリック標準ベクターでは、接頭語T1 / T2および接尾辞付きT3 / T4の4つのCpf1標的部位が生物学的部分に隣接する。これはBioBrick標準に似ています。 T2およびT3部位の切断として、p相補的な粘着末端を生じるので、DNA部分の反復アセンブリを実施することが可能であり、一方パーツ間に「GGATCC」傷を生成することが可能である。特に、C-Brick標準には2つの主な利点があります。長いターゲットシーケンスを認識し、短い傷跡を残します。 C-ブリックによって生成された6bpの「GGATCC」傷は、融合タンパク質の構築を可能にするGly-Serをコードする。さらに、C-Brick標準もBglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、DNAアセンブリ標準C-ブリックの手順を記載する。このプロトコルの最も重要なステップは、C-Brick標準ベクトルの線形化です。ベクターの不完全な切断は、成功率に重大な影響を及ぼす可能性がある。さらに、Cpf1は、主に「18-23」切断パターンの標的DNA配列を切断するが、2つの塩基の近くの不正確な切断もまた検出され、DNAアセンブリ後に少数の突然変異を引き起こす可…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C-Brick標準の開発中の技術支援については、Shanghai Tolo Biotechに感謝します。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム（助成金XDB19040200）の助成金によって支えられました。
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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