Summary
La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.
Abstract
La proteína Cpf1 asociada a CRISPR cliva ADN de doble cadena bajo la guía de ARN CRISPR (CRRNA), generando extremos pegajosos. Debido a esta característica, Cpf1 se ha utilizado para el establecimiento de un estándar de ensamblaje de ADN llamado C-Brick, que tiene la ventaja de sitios de reconocimiento largos y cicatrices cortas. En un vector estándar de C-Brick, hay cuatro sitios de reconocimiento Cpf1 - el prefijo (sitios T1 y T2) y el sufijo (sitios T3 y T4) - partes flanqueantes de ADN biológico. La escisión de los sitios T2 y T3 produce extremos pegajosos complementarios, que permiten el ensamblaje de partes de ADN con sitios T2 y T3. Mientras tanto, se genera una cicatriz corta "GGATCC" entre las piezas después del montaje. Como el plásmido recién formado contiene de nuevo los cuatro sitios de escisión de Cpf1, el método permite el ensamblaje iterativo de partes de ADN, que es similar a las de los patrones de BioBrick y BglBrick. Un procedimiento que describe el uso de la norma C-Brick para ensamblar partes de ADNSe describe aquí. El estándar de C-Brick puede ser ampliamente utilizado por científicos, estudiantes de posgrado y de pregrado, e incluso aficionados.
Introduction
La estandarización de las partes biológicas del ADN es importante para el desarrollo de la biología sintética 1 . El desarrollo de un procedimiento de ensamblaje de ADN puede reemplazar diseños experimentales ad hoc y eliminar muchos de los resultados inesperados que surgen durante el ensamblaje de componentes genéticos en sistemas más grandes. El estándar BioBrick (BBF RFC 10) fue uno de los primeros estándares de ensamblaje de ADN propuestos. Utiliza la secuencia de prefijo (que contiene sitios de corte EcoRI y XbaI) y la secuencia de sufijo (que contiene sitios de corte SpeI y PstI) 2 , 3 . Debido a que XbaI y SpeI tienen extremos cohesivos complementarios, las partes de ADN de BioBrick que se cortan con XbaI y SpeI se pueden unir, generando una nueva BioBrick para un montaje iterativo adicional.
Algunos defectos han sido identificados con el uso del estándar BioBrick 4 . Por ejemplo, produce una cicatriz de 8 pbEntre las partes de ADN, que no permite la construcción de proteínas en fusión. Además, los cuatro tipos de sitios de restricción de 6 pb mencionados anteriormente deben retirarse de las partes de ADN, lo cual es muy inconveniente. El estándar BglBrick se estableció para resolver el primer problema 5 . Crea una cicatriz de 6 pb "GGATCT", produciendo Gly-Ser y permitiendo la fusión de múltiples proteínas o dominios de proteínas. IBrick fue desarrollado para hacer frente al segundo problema 6 . Utiliza endonucleasas homing (HEs) que reconocen largas secuencias de ADN. Como los sitios de reconocimiento de HE rara vez existen en secuencias de ADN naturales, el estándar iBrick puede ser usado para la construcción directa de partes de iBrick sin modificar sus secuencias de ADN. Sin embargo, el estándar de iBrick deja una cicatriz de 21 pb entre las partes de ADN, lo que podría ser la razón de su impopularidad.
En los últimos años, las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR) se ha desarrollado rápidamente 7 , 8 . Entre las proteínas asociadas a CRISPR (Cas), la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes es ahora ampliamente utilizada. En su mayor parte introduce introducciones de doble cadena de ADN (DSB) con extremos romos 9 .
En 2015, Zhang y compañeros de trabajo caracterizaron Cpf1 (CRISPR de Prevotella y Francisella 1) por primera vez. Pertenece al sistema de tipo 2 CRISPR-Cas de tipo V y es una endonucleasa guiada por ARN de CRISRP (crRNA) 10 . A diferencia de Cas9, Cpf1 introduce un DSB con un 4 o 5 nt 5 'sobresaliente 10 . Basándose en esta característica, Cpf1 se utilizó para desarrollar un estándar de ensamblaje de ADN, C-Brick 4 . En un vector estándar de C-Brick, cuatro sitios objetivo Cpf1 de T1 / T2 prefijados y T3 / T4 sufijados flanquean las partes biológicas; Esto es similar al estándar BioBrick. Como la escisión de los sitios T2 y T3 pProduce extremos pegajosos complementarios, es posible realizar el montaje iterativo de partes de ADN mientras se genera una cicatriz "GGATCC" entre las partes. Cabe destacar que el estándar C-Brick tiene dos ventajas principales: reconocer secuencias largas de blanco y dejar cicatrices cortas. La cicatriz de 6 pb "GGATCC" generada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite la construcción de proteínas de fusión. Además, el estándar C-Brick es también parcialmente compatible con los estándares BglBrick y BioBrick.
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Protocol
1. Preparación de CRRNA
- Preparación de plantillas de CRRNA
- Re-suspender los oligonucleótidos individuales ( Tabla 1 ) en agua libre de RNasa a una concentración de 10 μM.
- Se a~naden 22,5 μl de oligonucleótido de hebra superior (T7-F en la Tabla 1 ), 22,5 μl de oligonucleótido de cadena inferior ( Tabla 1 ) y 5 μl de tampón de recocido 10x a un tubo de PCR de 0,2 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
NOTA: En la Tabla 1 se muestran seis oligonucleótidos diferentes de hebras inferiores, cada uno de los cuales debería estar emparejado individualmente con la hebra superior T7-F. Las letras minúsculas de la Tabla 1 representan la secuencia a transcribir en la secuencia guía de CRRNA. Se puede usar tampón Taq PCR 10x en lugar del tampón de recocido 10x. - Coloque el tubo de PCR en un termociclador.
- Ejecutar el programa de recocido: desnaturalización inicial a 95 ° C para5 min y luego un tiempo de reutilización de 95-20 ° C, con una disminución de 1 ° C por minuto en el termociclador.
NOTA: Utilice inmediatamente las muestras para el paso 1.2.1.
- Transcripción y purificación de CRRNA
- Se añaden 38 μl de agua libre de RNasa, 8 μl de la plantilla de la etapa 1.1.4, 20 μl de tampón de transcripción 5x T7, 20 μl de mezcla NTP (10 μM), 4 μl de inhibidor RNasa recombinante (RRI) y 10 μL Μl de ARN polimerasa T7 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 100 μL.
- Se pone el tubo de microcentrífuga en un baño de agua a 37 ° C durante la noche (durante aproximadamente 16 h).
- Utilice un kit de limpieza y concentración de ARN para purificar el ARN transcrito; Siga el protocolo del fabricante.
- Cuantificar los ARNs con espectrofotómetros UV-Vis y diluir el ARN a una concentración de 10 μ M. Utilice las muestras inmediatamente o almacénelas a -80 ° C.
NOTA: La secuencia de CRRNAS se enumeran en la Tabla 2 .
2. Construcción de piezas de C-Brick ( es decir, la inserción de partes biológicas en un vector estándar de C-Brick)
NOTA: Este paso tiene tres sub-pasos. Para las partes biológicas cortas ( por ejemplo, promotores y terminadores), es mejor utilizar el método de PCR directa para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick 4 . La secuencia completa del vector se muestra en los datos suplementarios, y la secuencia de prefijo y sufijo se muestra en la Figura 1 (paso 2.1, más adelante). Para las partes biológicas que pueden obtenerse fácilmente mediante PCR ( por ejemplo, con plantillas de ADN genómico, plásmidos o secuencias de ADN sintetizadas de novo ), es mejor utilizar el método de ensamblaje sin costuras para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (Paso 2.2, más adelante). Para las partes obtenidas de las normas BioBrick y BglBrick, la restricciónSe puede usar la digestión mediada por enzima y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar las partes biológicas en un vector estándar de C-Brick (etapa 2.3, más adelante).
- Construcción mediante amplificación directa por PCR
- Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
NOTA: El extremo 5 'del oligonucleótido contiene la secuencia de la parte de ADN, y el extremo 3' del oligonucleótido contiene la secuencia del vector ( es decir, "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" en el extremo 3 'de la hebra delantera y "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" En la cadena inversa). En el extremo 5 'del oligonucleótido no se puede diseñar ningún saliente ni un saliente de 20 pb. Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . - Re-suspender oligonucleótidos individuales en agua ultra pura a una concentración de 10 μ M.
- Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de 2x P1 μl de dNTPs (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM) del paso 2.1.2, 0,5 μl de vector estándar C-Brick (50 ng) como molde y 0,5 μl De DNA polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
- Coloque el tubo directamente en un termociclador e inicie el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
- Programa termociclador: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; Treinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C.
- Añadir 9 μl de la mezcla de la etapa 2.1.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 1 μl de DpnI e incubar durante 1 h en un baño de agua a 37 ° C.
NOTA: Si los cebadores no tienen secuencias solapadas, añada 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) y 0,5 μL de T4 DNA ligasa e incube enUn baño de agua a 22 ° C durante 1 h. De lo contrario, si los cebadores contienen una secuencia de superposición de ~ 20 nt, transformar directamente los productos tratados con DpnI en células compatibles con E. coli (DH10B) (etapa 2.4). El producto de PCR linealizado será circularizado por el sistema de recombinación en el huésped. - Utilice las muestras inmediatamente o guárdelas a -20 ° C.
- Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
- Construcción a través de un montaje sin fisuras
- Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
NOTA: El extremo 3 'del oligonucleótido contiene la secuencia terminal de la parte de ADN y el extremo 5' del oligonucleótido contiene el terminal de la secuencia de vector estándar linealizada de C - Brick ( es decir, "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" para el extremo 5 ' -end de la cadena delantera y "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" para el extremo 5 'de la cadena inversa). Ejemplos específicos se pueden encontrar en un estudio previo 4 . - Re-suspender el individuoUal en agua ultrapura a una concentración de 10 μM.
- Preparar reacciones de PCR en hielo en un tubo de PCR de 0,2 ml: añadir 18 μl de agua ultra pura, 25 μL de tampón de PCR 2x, 1 μl de dNTP (10 μM), 2,5 μl de cada uno de los cebadores directos e inversos (10 μM ) De la etapa 2.2.2, 0,5 μl de plantilla (20-500 ng) y 0,5 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Asegúrese de que el volumen total es de 50 μl.
- Coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el programa del termociclador. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
NOTA: Ajuste el programa del termociclador a: un ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (según la temperatura de recocido del cebador) y 1 min (según la longitud de las partes biológicas) a 72 ° C; Y un ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenga la muestra a 16 ° C. - Purificar el producto de PCR utilizando un sistema de limpieza de PCRKit de temperatura; Siga el protocolo del fabricante.
- Digerir el vector estándar C-Brick con BamHI: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μL de tampón 10x y 1 μl de BamHI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h a 37 ° C en un baño de agua.
- Purificar el producto anterior usando un kit de sistema de limpieza de gel; Siga el protocolo del fabricante.
- Añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.2.7, 5 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.2.4, 2 μl de tampón de ensamblaje sin costura 5x y 1 μl de enzima de ensamblaje sin costura de un kit de ensamblaje sin costura A un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Asegúrese de que el volumen total es de 10 μl.
- Colocar esto en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
- Diseñar y ordenar oligonucleótidos para la amplificación por PCR.
- Construcción mediante digestión mediada por enzimas de restricción y ligación mediada por ligasa de T4 ADN.
NOTA: Para las partes obtenidas de las normas BioBrick (etapa 2.3.4-2.3.7) y BglBrick (etapa 2.3.1-2.3.3), se puede utilizar la digestión mediada por enzimas de restricción y la ligación mediada por ligasa de T4-ADN para insertar la Biológicas en un vector estándar de C-Brick.- Digerir las partes estándar de BglBrick con BamHI y BglII: añadir 34 μl de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de BamHI y 0,5 μL de BglII en el tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
- Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel.
- Ligar el fragmento y el vector estándar de C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.1.12 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μ l de 10 x T4 ADN ligasa buffer y 1 μ l de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilice las muestras inmediatamente o freezE y almacenarlos a -20 ° C.
- Digerir las partes estándar de BioBrick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultra pura, 10 μL de plásmido (2 μg), 5 μL de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μL de SpeI al tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
- Digerir el vector estándar de C-Brick con XbaI y SpeI: añadir 34 μL de agua ultrapura, 10 μL de plásmido (1 μg), 5 μl de tampón 10x, 0,5 μL de XbaI y 0,5 μl de SpeI al tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h en un baño de agua a 37 ° C.
- Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa al 1% y purificar el fragmento de la etapa 2.3.4 y el vector linealizado de la etapa 2.3.5 con un kit de sistema de limpieza de gel; Siguiendo el protocolo del fabricante.
- Ligar el fragmento y el vector C-Brick: añadir 2 μl de vector linealizado (50 ng) de la etapa 2.3.5 y 6 μl de fragmento (200 ng) de la etapa 2.3.4 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. AnuncioD 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
- Añadir 10 μl de los productos de la etapa 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 para la transformación química en las células competentes de E. coli (DH10B).
- Recoger varios clones a un líquido de 5 ml Luria-Bertani (LB) tubo e incubar a 37 ° C en un agitador (220 rpm) durante la noche.
- Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante.
- Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 .
3. Ensamblaje del C-Brick ( Figura 2 )
- Digestión del vector C-Brick con Cpf1
- Añadir 22,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μl del plásmido de la etapa 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI y 1 μg de# 181; L de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Cpf1 puede adquirirse comercialmente o purificarse siguiendo el protocolo en un estudio previo 4 . - Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. A dd 1 μ l de CRRNA-T1 (10 μ M) y Cpf1 (5 μ M) durante otros 30 min.
NOTA: Alternativamente, para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T3 y T4, añadir 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos. Añadir 1 μ l de CRRNA-T4 (10 μ M) durante otros 30 min. - Añadir 1 μl de fosfatasa alcalina termosensible e incubar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante otras 1 h.
- Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el vector utilizando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
La digestión del fragmento de ADN con Cpf1 - Añadir 22,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μl del plásmido de la etapa 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI y 1 μg de# 181; L de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 21,5 μl de agua libre de RNasa, 4 μl de tampón Cpf1 10x, 10 μL de plásmido de la etapa 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI y 2 μl de Cpf1 (5 μM) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, añadir 1 μl de CRRNA-T1 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T3 (10 μM) e incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h.
NOTA: Alternativamente, añada 1 μl de CRRNA-T2 (10 μM) y 1 μl de CRRNA-T4 (10 μM) e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 2 h. - Ejecutar una electroforesis en gel de agarosa y purificar el fragmento usando un kit de sistema de limpieza de gel. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
- Ensamblaje de C-Brick y verificación adicional
- Ligar el fragmento de ADN extraño y el vector C-Brick: añadir 2 μl del vector linealizado (50 ng) de la etapa 3.1.4 y 6 μl del fragmento de ADN (200 ng) de la etapa 3.2.3 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 μl de tampón de ADN ligasa 10 x T4 y 1 μl de ADN ligasa T4. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Utilizar las muestras inmediatamente o congelarlas y almacenarlas a -20 ° C.
- Añadir 10 μl de los productos de ligación (etapa 3.3.1) para la transformación química en células competentes de E. coli (DH10B).
- Se agregan varios clones a un tubo LB líquido de 5 ml y se incuba durante la noche en un agitador a 220 rpm y 37ºC.
- Extraer el plásmido usando un kit de preparación de plásmido; Siga el protocolo del fabricante.
- Identificar los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger 11 .
- Realice una nueva ronda de ensamblaje C-Brick. Los clones correctos de la etapa 3.3.4 pueden usarse como un nuevo vector de C-Brick o parte de ADN para un montaje iterativo de C-Brick adicional, siguiendo el mismo protocolo de los pasos 3.1-3.3.
NOTA: T2 'y T3' sItes están diseñados como la copia de seguridad de los sitios T2 y T3 ( Figura 1a ). Para los plásmidos obtenidos de la etapa 2.3.7, sólo pueden utilizarse T2 'y T3' para el ensamblaje estándar de C-Brick.
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Representative Results
Este protocolo demostró el ensamblaje de tres casetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012), y amilGFP (BBa_K592010)). En primer lugar, las secuencias codificantes de los tres genes y terminadores mencionados anteriormente se clonaron individualmente en un vector estándar de C-Brick. Partes cortas de ADN, promotor y terminador, se introdujeron en el vector C-Brick mediante amplificación por PCR usando cebadores que contenían las partes cortas de ADN en el extremo 5 '. Esto fue seguido por el método de auto-ligación. Tres secuencias codificantes de la cromoproteína se sintetizaron primero de novo y luego se clonaron en el vector estándar de C-Brick a través de ensamblaje sin soldadura. Los cebadores se describieron en un estudio previo [ 4] .
Después de eso, las secuencias cjBlue, eforRed y amilGFP se ligaron con secuencias de terminador y promotor en el mismo procedimiento mostrado en"Xfig"> Figura 2. Los constructos correctos se transformaron en E. coli , demostrando hermosos colores ( Figura 3a ). Posteriormente, se ensamblaron dos casetes de expresión de color con el estándar C-Brick para crear más colores ( es decir, el color rojo de amilGFP más eforRed, el color verde de amilGFP más cjBlue y el color púrpura claro de eforRed más cjBlue; 3b ).
Figura 1: Secuencia de ADN de la interfaz estándar de C-Brick y vector estándar de C-Brick. (A) La secuencia de la interfaz estándar de ladrillo C -T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'- puede ser reconocida por su correspondiente CRRNA y luego introducida en un saliente 5' usando Cpf1. La escisión de los sitios T2 y T3 (o T2 'y T3') produce complementosSe cuelga Con los ocho sitios de restricción diseñados, el estándar C-Brick es parcialmente compatible con BioBrick y BglBrick. ( B ) Mapa de plásmido para el vector estándar de C-Brick con sitios de digestión de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El flujo de trabajo para la Asamblea de ADN en la norma C-Brick. Los sitios diana T2 y T3 digeridos con Cpf1 producen extremos cohesivos complementarios de "GGATC" y "GATCC", respectivamente, que pueden ligarse para generar una cicatriz corta de "GGATCC". Los procedimientos detallados se pueden encontrar en el paso 3 del texto ("C-Brick assembly"). Haga clic aquí para Ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Colorantes pigmentos bacterianos producidos por E. coli Harboring Constructs montado en el C-Brick Standard. (A) Se expresaron tres cromoproteínas en E. coli cultivadas en una placa. Las bacterias sin cromoproteínas (control negativo) se muestran en la 4ª placa. ( B ) Se expresaron tres cromoproteínas y tres cromoproteínas ensambladas en E. coli cultivadas en medio LB líquido. De 1 a 6, las construcciones expresaron eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP más eforRed (4), amilGFP más cjBlue (5) y eforRed más cjBlue (6). Las bacterias coloridas en una sola placa o en un solo tubo de microcentrífuga se cultivaron a partir de un único clon verificado por secuencia. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| nombre | secuencia | ||
| T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
| T7-T1-R | GaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2'-R | CtagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2-R | GgatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3-R | GgatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3'-R | CtctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T4-R | TtcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
Tabla 1: Oligos para la preparación de las plantillas de transcripción de CRRNA utilizadas en este estudio. T7-F era el oligonucleótido de la hebra superior, y los otros eran los oligonucleótidos de la hebra inferior. Las bases en minúsculas en la secuencia se transcribirán en la secuencia guía en CRRNA.
| Nombres | Secuencias de ARN (5'-3 ') | ||
| CrRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
| CrRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
| CrRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
| CrRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA | ||
| CrRNA - T2 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
| CrRNA - T3 ' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG | ||
Tabla 2: Secuencias de CRRNA utilizadas en este estudio. Los crRNAs se produjeron a través de la transcripción in vitro en el paso 1 en el texto ("Preparación de CRRNA").
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Discussion
Este protocolo describe un procedimiento para el ensamblaje de ADN estándar C-Brick. El paso más importante en este protocolo es la linealización del vector estándar de C-Brick; La escisión incompleta del vector podría afectar seriamente la tasa de éxito. Adicionalmente, aunque Cpf1 escinde principalmente secuencias de ADN diana en el patrón de escisión "18-23", también se detectó una escisión imprecisa cerca de las dos bases 4 , lo que puede causar un pequeño número de mutaciones después del montaje del ADN. Por lo tanto, la secuenciación de Sanger es necesaria para verificar la construcción ensamblada.
La eficiencia de la C-Brick montaje es inferior a la tradicional enzima de restricción y ligadura métodos que se han descrito en un estudio anterior [ 4] . La razón principal que afecta a la eficiencia del ensamblaje puede ser las características de corte inexactas de Cpf1. En el futuro, las mejoras en la precisión de la división pueden ser extremadamente útiles para la norma aNd se están explorando actualmente.
C-Brick es también parcialmente compatible con los estándares BglBrick y BioBrick. Por ejemplo, las partes de BglBrick se pueden cortar con BglII y BamHI y luego se insertan en el sitio BamHI de un vector estándar de C-Brick, generando una parte de C-Brick. Sin embargo, la dirección de inserción de la parte de BglBrick debe ser verificada, y habría una cicatriz "GGATCT" después del montaje. Cuando se obtiene una parte de ADN de C-Brick a partir de una parte de BioBrick ( es decir, con digestión con XbaI y SpeI), se destruirán ambos sitios T2 y T3 y se pueden usar dos secuencias diana Cpf1 de reserva (T2 'y T3').
Como la escisión Cpf1 requiere sgRNA, que es extremadamente sensible a la RNasa, todos los materiales deben estar libres de RNasa. Actualmente, todos los vectores estándar de C-Brick, nucleas Cpf1 libres de RNasa y CRRNAs se pueden pedir comercialmente 12 . Por lo tanto, los procedimientos para C-Brick son en realidad tan simples como los de la BioLadrillo estándar.
En los últimos años, se han desarrollado varios métodos útiles de ensamblaje de ADN, que son ampliamente utilizados, entre ellos Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 y otros 15 . Sin embargo, como los estándares de ensamblaje de ADN tienen el potencial de proporcionar reacciones de ensamblaje rentables, confiables, de alto rendimiento y automáticas 5 , las normas pueden facilitar la construcción y la prueba de genes, circuitos genéticos y vías recién diseñados o rediseñados 15 , 16 , 17 , especialmente en el campo de la biología sintética. Entre los estándares de ensamblaje de ADN actualmente publicados, el estándar C-Brick tiene ventajas y desventajas evidentes 4 ( es decir, la eficacia de ligación). Si se mejora la eficacia de la ligadura, la norma puede ser ampliamente adoptada en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Shanghai Tolo Biotech por su asistencia técnica durante el desarrollo de la norma C-Brick. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (Grant No. XDB19040200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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