Bruk av Immunolabeling å analysere stabil, dynamisk og gryende piskehale som henger i sebrafisk Embryo
Summary
Immunolabeling metoder for å analysere ulike bestander piskehale som henger i utviklingsland sebrafisk hjernen er beskrevet her, som er bredt aktuelt andre vev. Første protokollen skisserer en optimalisert metode for immunolabeling stabile og dynamisk piskehale som henger. Andre protokollen inneholder en metode for å image og kvantifisere begynnende piskehale som henger spesielt.
Abstract
Piskehale som henger (MTs) er dynamisk og skjøre strukturer som er vanskelig å image i vivo, spesielt i virveldyr embryoer. Immunolabeling metoder er beskrevet her for å analysere forskjellige populasjoner av MTs i den utvikle medfødte av sebrafisk fosteret. Mens fokus er på neural vev, er denne metodikken generelt gjelder andre vev. Prosedyrene er optimalisert for tidlig til midten av-somitogenesis-scene embryo (1 somite til 12 somites), men de kan tilpasses en rekke andre faser med relativt små justeringer. Første protokollen inneholder en metode for å vurdere den romlige fordelingen av stabil og dynamisk MTs og utføre en kvantitativ analyse av disse gruppene med bildebehandling programvare. Dette utfyller eksisterende verktøy til bildet microtubule dynamikk og distribusjon i sanntid, bruke transgene linjer eller forbigående uttrykk for merket konstruksjoner. Faktisk er er slike verktøy meget nyttig, men de ikke lett skiller mellom dynamisk og stabil MTs. Bilde og analysere populasjonene distinkte microtubule har viktige implikasjoner for forstå mekanismene bak celle polarisering og morphogenesis. Andre protokollen beskriver en teknikk for å analysere begynnende MTs spesielt. Dette gjøres ved å fange de novo vekst egenskapene for MTs over tid, etter microtubule depolymerization med narkotika-nocodazole og en restitusjonsperiode etter narkotika bleke. Denne teknikken har ennå ikke brukt til studiet av MTs i sebrafisk embryoer, men er en verdifull analysen for å undersøke funksjonen i vivo proteiner involvert i microtubule montering.
Introduction
Piskehale som henger (MTs) er polymerer av α – og β-tubulin som monterer til lineær protofilaments, hvorav flere sammen danner et hult rør1,2. MTs er polarisert strukturer med raskt voksende pluss ender og sakte voksende minus ender som er forankret i centrosome eller andre microtubule-organisere center (MTOC)3. De novo MT-formasjonen er initiert av nucleation på γ-tubulin ring kompleks (γ-TURC), som gir en mal for MT montering4. I en gitt celle, kan to bestander av MTs skilles det slå til ulike priser. Dynamisk MTs utforske sine mobile miljøet ved å bytte mellom faser av vekst og krymping i en prosess som kalles dynamisk ustabilitet5. I motsetning til dynamisk MTs, stabil MTs er ikke hurtigvoksende og har en lengre halveringstid enn dynamisk MTs6.
Tiår med forskning i cell biology har gitt et sofistikert utvalg av verktøy for å studere MT struktur og funksjon og resulterte i en stor mengde kunnskap om disse cellen cytoskjelett elementene. For eksempel MTs spille en sentral rolle i etableringen og vedlikeholdet av cellen polaritet, som skyldes ikke bare til deres iboende polaritet, men også til differensial subcellular distribusjon av stabil versus dynamisk MTs7, 8. derimot langt mindre er forstått om MT arkitektur og funksjon i mer komplekse tredimensjonale (3D) miljøer som virveldyr embryoet, delvis på grunn av utfordringen med imaging MT cytoskeleton med høy oppløsning. Til tross for denne begrensningen, den siste generasjonen av GFP-uttrykke transgene linjer denne etiketten MTs eller forbigående uttrykk for fluorescently-merket MT markører har økt vår forståelse av de dynamiske endringene som MTs gjennomgå og deres cellular og utviklingsmessige rolle i sebrafisk fosteret. Hele MT nettverket kan avbildes transgene linjene i hvilke tubulin er enten direkte merket9 eller tubulin polymerer indirekte merket med MT-assosiert proteiner Doublecortin-lignende-kinase (Dclk) eller Ensconsin (EMTB)10, 11. Andre linjer (og konstruksjoner) har blitt generert som aktiverer vurdering av MT iboende polaritet ved spesielt merking MT pluss ender eller centrosome-forankret minus ender11,12,13, 14. kraften i disse verktøyene ligger i evnen til å studere MT dynamikk i live, utvikle organismer. Slike undersøkelser har avdekket, for eksempel romlige og dynamisk distribusjon av MTs bestemt celle bestander, retningen på mitotisk spindles vev gjennomgår morphogenesis (en indikator på flyet celledeling), polariteten til MT polymer i tilknytning til prosesser som cellen forlengelse og migrasjon, og MT vekstrate bestemmes av kometen hastighet9,13,15. Begrensning av disse verktøyene er at de lett ikke diskriminerer mellom stabil og dynamisk MT bestander.
Tegning fra de rike celle biologi litteraturen, er immunolabeling metoder å image stabil og dynamisk MTs i sebrafisk embryo beskrevet her, som er komplementære til bruken av transgene linjer. Den utstrakte bruken av slike immunolabeling metoder i sebrafisk har vært noe hemmet av vanskeligheten i å bevare MT integritet under fiksering prosedyren. Protokollen 1 skisserer en optimalisert metode for immunolabeling totalt, dynamisk, og stabil MTs i tverrsnitt av det utvikle sebrafisk-hindbrain. Videre er en enkel metode bruke kommersielt tilgjengelig programvare beskrevet for å kvantifisere populasjonene MT. Stabil MTs er forskjellig fra dynamisk MTs basert på flere post-translasjonell modifikasjoner av α-tubulin, som acetylation og detyrosination, som samler seg på stabil MTs over tid16,17. I sebrafisk embryoet skjer acetylation på ciliary og axonal MTs men ikke stabil interphase MTs18, begrense nytten av denne indikatoren til et delsett med stabilisert MTs. Derimot vises detyrosination på alle stabil MTs sebrafisk embryoet18. Denne post-translasjonell modifikasjon eksponerer carboxy-terminal Glutaminsyre α-tubulin (detyrosinated tubulin)18 og kan oppdages ved hjelp av anti-Glu-tubulin19. Selv om detyrosination forekommer fortrinnsvis på stabil MTs, indikerer eksperimentelle bevis at denne post-translasjonell modifikasjon er et resultat av, snarere enn en årsak til, MT stabilitet16. Gjensidige MT befolkningen, består av dynamisk MTs, kjennetegnes ved hjelp av et antistoff, anti-Tyr-tubulin, som anerkjenner spesielt tyrosinated form av α-tubulin19. Etter immunolabeling med disse markører og AC confocal imaging, kvantitativ analyse av MTs (lengde, antall og relative overflod) kan utføres i definerte regioner i den utvikle medfødte. En strømlinjeformet metoden tilbys her for å utføre denne analysen med 3D bildebehandling programvare. Denne metoden kan brukes å svare på spørsmål om morphogenesis og etablering eller modning av cellen polaritet20. Faktisk følger utarbeidelsen av polarisert matriser av stabil MTs mange utviklingsmessige arrangementer, inkludert photoreceptor morphogenesis21, epithelialization celler i utviklingsland medfødte18 og axon formasjon8.
Protokollen 2 beskriver i vivo tilpasning av en celle biologi analysen analysere MTs under deres montering fase (nucleation/anchorage og vekst)22,23. Begynnende MTs er nucleated på centrosome og senere forankret til subdistal vedheng mor centriole23. En metode for å analysere begynnende MT gjengroing følge depolymerization er beskrevet. Denne protokollen gir detaljer om nocodazole behandling til depolymerize MTs, narkotika bleke prosedyren og etter behandling restitusjonsperiode. MT ettervekst overvåkes med jevne mellomroms innlegg bleke av immunolabeling med merker for totalt MTs (anti β-tubulin) sammen med markører for centrosome (anti γ-tubulin) og kjernen (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), i henhold til de generelle fremgangsmåtene i protokollen 1. MT depolymerization trinnet av denne protokollen er viktig ettersom vurdering av de novo MT vekst ikke utvidelsen av eksisterende MTs. Denne teknikken er derfor forskjellig fra andre publiserte prosedyrer å måle MT vekstrater (i fravær av depolymerization) ved hjelp av en pluss tips markør som end bindende protein 3 smeltet grønne fluorescerende protein (EB3-GFP), som vist i Tran et al., 201211. Videre denne analysen er spesielt nyttig for å analysere embryo defekt i de novo MT montering, som tidligere rapporterte NEDD1 mutanter der rekruttering av γ-tubulin til centrosome er svekket, noe som resulterer i ufullstendige medfødte dannelse og neuronal defekter24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finnes mange metoder for bildebehandling MT dynamikk i tidlig sebrafisk utvikling, mellom live bildebehandling merket molekyler immunolabeling av fast vev11,12,13,14. Selv om MTs i en enkelt celle kan eksistere i dynamisk eller stabil stater, er epithelialization en prosess der MTs er gradvis stabilisert over tid. Bruke markører for stabil og dynamisk MTs tilbyr en måte å visualisere det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AC confocal mikroskop ble kjøpt med midler fra det amerikanske National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. Forskningen ble støttet av amerikanske nasjonale institutter for helse/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) gi #GM085290 og US Department of Defense (DOD) gi #W81XWH-16-1-0466 til RM Brewster. E. Vital ble støttet av et stipend til UMBC fra Howard Hughes Medical Institute gjennom pre college og Undergraduate Science Education Program, gi #52008090. S.P. Brown ble støttet av en US Department av utdanning GAANN fellesskap, en Meyerhoff Graduate Fellowship finansiert av NIH/NIGMS grant #GM055036, og en forskning Assistantship finansiert av den amerikanske DOD grant #W81XWH-16-1-0466.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
