השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה
Summary
Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.
Abstract
Microtubules (MTs) הם דינמיים ושבירה במבנים מאתגר התמונה ויוו, בפרט העוברים בעלי. החוליות. שיטות Immunolabeling מתוארים כאן ולנתח אוכלוסיות נפרדות של MTs בצינור העצבי המתפתח של העובר דג זברה. כאשר המוקד הוא על רקמה עצבית, מתודולוגיה זו ישימה בהרחבה לרקמות אחרות. ההליכים ממוטבים מוקדם עד אמצע-somitogenesis-שלב עוברי (1 somite כדי 12 somites), אולם הם יכולים להיות מותאמים למגוון שלבים אחרים עם התאמות קלות יחסית. הפרוטוקול הראשון מספק שיטה להעריך את התפוצה המרחבית של MTs יציבה ודינמית ולבצע ניתוח כמותי של אוכלוסיות אלה עם תוכנות עיבוד תמונה. גישה זו משלימה הכלים הקיימים כדי התמונה microtubule dynamics והפצה בזמן אמת, באמצעות קווים הטרנסגניים או בביטוי ארעית של בונה מתויגות. ואכן, כלים כאלה הם מאוד שימושי, אולם הם אינם ברצון מבחינים בין MTs דינמית ויציבה. היכולת תמונה ולנתח אוכלוסיות נפרדות microtubule אלה יש השלכות חשובות על מנגנונים ההבנה שבבסיס תא קיטוב, מורפוגנזה. פרוטוקול השני מתאר טכניקה כדי לנתח nascent MTs במיוחד. זו מושגת על-ידי לכידתו של מאפייני הצמיחה דה נובו MTs לאורך זמן, בעקבות microtubule depolymerization עם nocodazole הסמים ותקופת ההתאוששות לאחר שטיפה סמים. טכניקה זו לא הוחל עדיין במחקר של MTs בדג זברה עוברי, אבל וזמינותו יקר על חקירת הפונקציה ויוו של חלבונים מעורבים microtubule הרכבה.
Introduction
Microtubules (MTs) הם פולימרים של α – ו β-טובולין. זה להרכיב לתוך protofilaments ליניארית, כמה מהם לשלב כדי ליצור צינור חלול1,2. MTs הם מבנים מקוטב, עם בצמיחה מהירה פלוס מסתיים, הגדלים לאט מינוס מסתיים שמעוגנים את centrosome או אחרים ארגון microtubule center (MTOC)3. דה נובו היווצרות MT הוא שיזם התגרענות בγ-טובולין. הטבעת מורכבת (γ-TURC), אשר מספק תבנית עבור הרכבה MT4. בתא נתון כלשהו, שתי האוכלוסיות של MTs ניתן להבחין את הפניה הזאת מעל בקצב שונה. MTs דינמי לחקור את הסביבה התאית שלהם על ידי מיתוג בין שלבי צמיחה הצטמקות בתהליך המכונה יציבות דינאמית5. בניגוד MTs דינמי, MTs יציב שאינו גדל, יש מחצית חיים ארוך יותר מאשר MTs דינמי6.
עשורים של מחקר ב ביולוגיה של התא יש מספק מערך מתוחכם של כלים ללמוד MT מבנה ותפקוד וכתוצאה גוף גדול של ידע על אלה אלמנטים cytoskeletal. למשל, MTs לשחק תפקיד המרכזי ובשימור תא קוטביות, אשר לא רק לייחס קוטביות מהותי שלהם, אלא גם כלפי ההתפלגות subcellular דיפרנציאלית של יציבה לעומת דינמי MTs7, 8. לעומת זאת, הרבה פחות מובנת על אדריכלות MT ותפקוד בסביבות מורכבות יותר תלת-ממדיים (3-D), כגון העובר חוליות, בחלקו בשל האתגר של הדמיה של שלד התא MT ברזולוציה גבוהה. למרות מגבלה זו, הדור האחרון של GFP-הבעת הטרנסגניים קווים שהמדבקה MTs או ארעי ביטוי מתויג fluorescently MT סמני גדל ההבנה שלנו של השינויים הדינמיים MTs עוברים וסלולר שלהם, תפקיד התפתחותי העובר דג זברה. הרשת MT יכול לדימות הטרנסגניים שורות אילו טובולין מתבצע ישירות פולימרים9 או טובולין עם תוויות מסומנות באופן עקיף באמצעות חלבונים הקשורים MT Doublecortin-כמו-קינאז (Dclk) או Ensconsin (EMTB)10, 11. קווים אחרים (וגם בונה) נוצרו לאפשר הערכה של קוטביות מהותי MT על-ידי תיוג במיוחד הר plus מסתיים או centrosome-מעוגן מינוס מסתיים11,12,13, 14. הכוח של כלים אלה טמון ביכולת בחקר דינמיקה MT ב live, פיתוח אורגניזמים. מחקרים גילו, לדוגמה, התפלגות מרחבית ודינאמי של MTs אוכלוסיות תאים מסוים, כיוון mitotic spindles ברקמות שעברו מורפוגנזה (אינדיקטור של המטוס של חלוקת התא), את הקוטביות של הפולימר MT ככל שהוא מתייחס לתהליכים כגון התארכות התא, הגירה, קצב הצמיחה MT נקבע על ידי שביט מהירות9,13,15. המגבלה של כלים אלה היא כי הם לא ברצון להפלות בין אוכלוסיות MT יציבה ודינמית.
ציור מן הספרות ביולוגיה התא עשיר, שיטות immunolabeling תמונה יציבה ודינמית MTs ב העובר דג זברה מתוארים כאן, אשר הם משלימים על השימוש הטרנסגניים קווים. השימוש הנרחב של כזה שיטות immunolabeling דג זברה יש כבר הקשו במידת מה על ידי הקושי בשימור תקינות MT במהלך ההליך קיבעון. פרוטוקול 1 מתאר שיטה ממוטב עבור סך immunolabeling, דינמי, וחצו MTs יציב ב סעיפים hindbrain המתפתח דג זברה. יתרה מזאת, שיטה פשוטה באמצעות מסחרית התוכנה הזמין מתואר לכמת אוכלוסיות אלה MT. MTs יציב נבדלים MTs דינמי המבוסס על מספר שינויים post-translational של α-טובולין, כגון acetylation ו- detyrosination, אשר מצטברים MTs יציבה לאורך זמן16,17. העובר דג זברה, acetylation חל על MTs ciliary, עצב אך לא על יציבה לאטמוספרה MTs18, הגבלת את התועלת של סמן זה לתת-ערכה של MTs מיוצב. לעומת זאת, detyrosination מופיע כך שיתרחשו MTs יציבה כל העובר דג זברה18. שינוי post-translational זה חושף את חומצה גלוטמית carboxy-מסוף של α-טובולין (detyrosinated טובולין)18 , ניתן להבחין באמצעות אנטי-Glu-טובולין19. למרות detyrosination מעדיפים מתרחש MTs יציב, ראיות מציין את השינוי post-translational הוא תוצאה של, יותר מאשר גורם לחוסר יציבות MT16. האוכלוסייה MT הדדיים, המורכב MTs דינמי, מזוהה באמצעות נוגדן, אנטי-Tyr-טובולין, זה במיוחד מזהה את הצורה tyrosinated של α-טובולין19. בעקבות immunolabeling עם סמנים אלה קונאפוקלית הדמיה, ניתן לבצע ניתוח כמותי של MTs (אורך, מספר ושפע היחסי) באזורים מוגדרים של הצינור העצבי המתפתח. שיטה יעילה מסופק כאן לביצוע ניתוח זה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית. בשיטה זו ניתן להחיל על שאלות בנוגע מורפוגנזה לבין הממסד או ההבשלה של התא קוטביות20. אכן, לפתח של מערכים מקוטב של MTs יציב מלווה אירועים התפתחותיים רבים, כולל מורפוגנזה קולט אור21, epithelialization של תאים בפיתוח שפופרת פגמים בתעלה18 ו האקסון היווצרות8.
פרוטוקול 2 מתאר ויוו עיבוד של assay ביולוגיה התא כדי לנתח MTs במהלך שלהם הרכבה שלב (התגרענות/anchorage וצמיחה)22,23. MTs המתהווה nucleated-centrosome, לאחר מכן מעוגנת תוספות subdistal של אמא צנטריול23. מתוארת שיטה לנתח nascent לצמיחה מחודשת MT בעקבות depolymerization. פרוטוקול זה מספק פרטים על הטיפול nocodazole depolymerize MTs, ההליך שטיפה סמים ואת תקופת ההחלמה שלאחר הטיפול. MT מחדש את הצמיחה מנוטר על מרווח קבועs שטיפה פוסט מאת immunolabeling עם סמנים עבור MTs הכולל (אנטי-β-טובולין) לצד סמני centrosome (אנטי-γ-טובולין) ואת גרעין (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)), על פי כללי בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול 1. השלב depolymerization MT של פרוטוקול זה חיוני כפי שהיא מאפשרת הערכה של דה נובו MT צמיחה ולא סיומת של MTs שישנו. טכניקה זו ולכן היא נבדלת הליכים אחרים שפורסמו למדידת שיעורי צמיחה MT (בהעדר depolymerization) באמצעות סמן קצה פלוס כגון end מחייב חלבון 3 דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (EB3-GFP), כפי שמוצג טראן. et al., 201211. יתר על כן, וזמינותו זה שימושי במיוחד עבור ניתוח עוברי פגומים בהרכבה דה נובו MT, כגון המוטציות NEDD1 שדווחה בעבר שבו גיוס של γ-טובולין כדי centrosome פגום, וכתוצאה מכך לא שלם היווצרות שפופרת פגמים בתעלה, ליקויים עצביים24.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיום ישנן שיטות רבות הדמיה MT הדינמיקה של התפתחות מוקדמת של דג זברה, ועד הדמיה חיה של מולקולות מתויגות immunolabeling של קבוע רקמות11,12,13,14. למרות MTs בתא יחיד יכולה להתקיים במצבים דינמיים או יציבה, epithelialization הוא תהליך שבו MTs בהדרגה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיקרוסקופ קונפוקלי נרכש בכספים מ ארה ב הלאומית למדע קרן (NSF), גרנט #DBI-0722569. המחקר נתמך על ידי ארה ב הלאומית מכוני בריאות/לאומי המכון של גנרל רפואי למדעים (NIH/NIGMS) גרנט #GM085290, ארה ב המחלקה של ההגנה (DOD) גרנט #W81XWH-16-1-0466 מוענק ברוסטר חומרי גלם. אי חיוניים נתמך על ידי מענק כדי UMBC הווארד יוז מכון רפואי דרך המכללה מראש לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית, להעניק #52008090. פ מ בראון נתמכה על ידי ארצות הברית מחלקת של החינוך GAANN מלגת, מלגת בוגר מאירהוף ממומן על ידי מענק NIH/NIGMS #GM055036, Assistantship של מחקר שמומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי גרנט #W81XWH-16-1-0466.
Materials
| Low Melting Point Agarose | IBI scientific | IB70050 | Only used for embedding. Prepare 4% LMP agarose by heating a solution of 4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured |
| Agarose | Used to treat petridishes. Prepare 1% agarose by heating a solution of 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized. |
||
| Nocodazole | Sigma | 487928-10MG | Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots. Store at -20 ˚C. |
| 8% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Kpipes | Sigma | P7643 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| NP-40 | American Bioanalyticals | AB01424 | |
| EGTA | Sigma | E3889-25G | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-500G | |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ml | Aliquot and store at -20 ˚C. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605 | |
| Triton-x | American Bioanalyticals | AB02025 | |
| Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) | Sigma | P5147-1G | make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C. |
| Anti-Fade mounting medium | Invitrogen | P10144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months. |
| Mouse anti-β-tubulin | Developmental studies Hybridoma Bank | E7 | 1/200 |
| Rabbit anti-γ-tubulin | Genetex | GTX113286 | 1/500 |
| Rabbit anti-α-tubulin | Genetex | GTX108784 | 1/1000* |
| Rabbit anti-detyrosinated-tubulin | Millipore | AB3201 | 1/200-1/1000* Titrate antibody with first use of new lot. |
| Rabbit anti-tyrosinated-tubulin | Millipore | ABT171 | 1/500 |
| Mouse anti-centrin | Millipore | 04-1624 | 1/1000 |
| Goat 488 anti-rabbit | Thermofisher | A11008 | 1/500 |
| Goat 594 anti-rabbit | Thermofisher | A11012 | 1/500 |
| Goat 594 anti-mouse | Thermofisher | A11005 | 1/500 |
| Goat 488 anti-mouse | Thermofisher | A11001 | 1/500 |
| Vibratome | Vibratome | 1500 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 555227F | |
| 100 mm petri dish | Cell treat | 229693 | |
| 35 mm petri dish | Cell treat | 229638 | |
| 50 ml falcon tube | Fisher | 14-432-22 | |
| Woven nylon mesh 70 um | Amazon.com | B0043D1SZG | |
| Micropipette | Gilson | F123602 | |
| Glass pipette | Fisher | NC-999363-9 | |
| Aquarium sealant | Amazon.com, by MarineLand | Silicone Sealer 1 oz (Tube) | |
| Ring stand | Fisher | 14-675BO | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID | Cole-Parmer | WU-06417-21 | |
| Modeling clay | Amazon.com | Sargent Art 22-4000 | Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice |
| Clamp | Fisher | 02-215-466 | |
| 60ml syringe | Fisher | 14-820-11 | |
| Embryo medium (E3) | 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. |
||
| Blocking Solution | 50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X |
||
| TBS-NP-40 (pH 7.6) | 155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40 |
||
| 2x MAB (pH6.4) | 160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2 |
||
| Commercial 3-D Image processing Software | PerkinElmer | Volocity (V 6.2) | |
| Dry block heater | VWR | 12621-108 | Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1. |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ12 | |
| Confocal Microscope | Leica | SP5 | |
| Flat embedding mold | emsdiasum.com | BEEM 70904-01 | |
| Public domain image processing software | NIH | ImageJ (V 1.5) | |
| * Success varies by lot number |
References
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
- Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
- Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
- Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
- Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
- Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
- Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
- Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
- Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
- Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
- Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
- Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
- Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
- Lee, S. -. J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
- Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
- Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 – Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
- Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
- Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
- Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
- Nam, S. -. C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
- Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
- Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
- Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
- Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
- FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
- . ImageJ User Guide – IJ 1.46 Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010)
- . Z-functions – ImageJ Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017)
